2014—2016年河南省鼠类携带汉坦病毒的病原学分析

杜燕华，李懿，马宏，王海峰，许汴利，黄学勇

2014—2016年河南省鼠类携带汉坦病毒的病原学分析

杜燕华，李懿，马宏，王海峰，许汴利，黄学勇△

目的分析河南省鼠类携带汉坦病毒的基因型别和病原学特点。方法选取2014—2016在驻马店市确山县捕获的600只鼠类标本，分析该地区野外和居住区优势鼠种和鼠密度。采用RT-PCR法扩增鼠肺标本中汉坦病毒的特异性片段（M和S片段），以M片段（2 003～2 302 nt）构建系统发生树，分析基因亚型和进化特点。结果确山县野外优势鼠种为褐家鼠和黑线姬鼠，鼠密度在1.33%～1.83%；居住区优势鼠种为褐家鼠、小家鼠和黄胸鼠，鼠密度1.36%～1.97%。RT-PCR结果显示2014年3只鼠携带汉坦病毒，鼠种分别为小家鼠、大仓鼠和褐家鼠。3株病毒M片段和S片段核苷酸同源性均为100%，基于M片段的系统进化分析显示属于S4亚型汉城型汉坦病毒，与韩国和我国湖北省分离的病毒亲缘关系较近。结论河南省确山县鼠类携带的汉坦病毒为S4亚型，宿主范围广泛，有必要采取相关防控措施，预防肾综合征出血热的流行。

肾综合征出血热；汉坦病毒；基因型；河南；病原学；系统进化分析

肾综合征出血热是由汉坦病毒引起的、以啮齿类动物为主要传染源的一种自然疫源性疾病。该病分布广泛，已成为世界公共卫生问题。我国是受肾综合征出血热危害最为严重的国家之一，目前31个省、市、自治区均有病例报告，发病人数占世界报道病例的90%以上［1-2］。20世纪八、九十年代，河南省曾是我国出血热的重发病省份，近年来随着人们生活水平和卫生意识的提高，河南省的发病人数大幅下降。为了进一步了解河南省出血热的宿主动物的病毒携带情况和病原特征，笔者对2014—2016年肾综合征出血热国家级监测点驻马店市确山县的鼠肺组织进行了核酸检测和序列分析，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源及试剂 2014—2016年春季和秋季，按照《全国肾综合征出血热监测方案》，在国家级监测点河南省驻马店市确山县的野外和居住区用鼠笼捕获老鼠，计算鼠密度并对鼠种进行分类鉴定，无菌解剖取鼠肺组织，放于液氮罐中保藏。全自动核酸提取仪及相关试剂盒购自西安天隆科技有限公司，组织研磨器（MM200型）购自德国RETSCH公司，一步法RT-PCR试剂购自德国Qiagen公司。鼠密度（%）=捕鼠只数/布夹数。

1.2 鼠肺组织研磨和RNA提取 每只鼠肺组织取50～100 mg，置于加有5 mm直径钢珠，500 μL生理盐水的离心管中，在组织研磨器中震荡研磨（800 Hz，3 min）后，10 000 r/min 离心5 min。取上清200 μL，按照核酸提取试剂盒说明书提取核酸 100 μL，-70℃保存。

1.3 汉坦病毒核酸检测 参考文献［3］，委托上海生工生物工程有限公司合成扩增汉坦病毒的2对引物：S片段上游5′-ATGTTGCCTGGGGIAAAGAGG-3′，下 游 5′-GCGCACTAGTAGTAGTAGACTCCCTAAAGA-3′，扩增长度 450 bp；M片段上 游 5′-AAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGGG-3′，下游 5′-GTACAICCTGTRCCIACCCC-3′，扩增长度 463 bp。一步法反应体系如下：5×OneStep RT-PCR Buffer 10 μL，dNTP Mix（含 10 mmol/L of each dNTP）2 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各 1 μL，RNA 模板 5 μL;OneStep RT-PCR Enzyme Mix 2 μL，灭菌水补足至 50 μL。RT-PCR 条件：50 ℃30 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 45 s，35 个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察并记录实验结果。获得阳性汉坦病毒S和M片段扩增产物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。

1.4 同源性分析与系统发生树的构建 将测序结果用DNAstar进行拼接，上传GenBank数据库。利用ClustalX软件进行序列比对，Bioedit软件将汉坦病毒的M片段进行剪切。从NCBI数据库下载其他地区分离的汉坦病毒序列后进行同源性分析，最后采用MEGA 5.0软件用邻位相连法（Neighbor-joining Method，NJ）构建系统进化树，分析采用1 000个多序列组（replicates）。

2 结果

2.1 确山县宿主动物监测结果 2014—2016年确山县共捕鼠600只。其中，野外优势鼠种为褐家鼠和黑线姬鼠，鼠密度在1.33%～1.83%；居住区优势鼠种为褐家鼠、小家鼠和黄胸鼠，鼠密度1.36%～1.97%，见表 1。

2.2 鼠肺标本的核酸检测和序列测定 核酸检测结果显示，3只鼠肺汉坦病毒M和S片段扩增均为阳性，均为2014年秋季捕获，其中居住区2只，野外1只。将扩增的PCR阳性产物测序，经NCBI BLAST比对，为汉城型汉坦病毒（SEOV），将序列信息上传NCBI，获得GenBank登录号，见表2。

Tab.1 Specie information of monitored rats in Qushan county,2014-2016表1 2014—2016年确山县鼠种监测情况

Tab.2 Information of rat samples with Hantann virus in Queshan country,2014表2 2014年确山县携带汉坦病毒的鼠标本信息

2.3 核酸序列同源性比较 此次测定的3份鼠肺标本所携带的汉坦病毒，M片段和S片段之间的核苷酸同源性均为100%。从NCBI数据库下载12株S1～S5五个基因亚型的汉城型病毒（GenBank登录号分别为 AF035832/S1、AF288652/S1、AB027087/S2、 AB027088/S3、 AF190119/S3、 DQ159911/S3、S47716/S4、AB027521/S5、AB027083/S1、AF035833/S1、S72343/S4、AB027086/S2），基于此次扩增的部分M片段进行核酸序列比较，发现与S4亚型的同源性最高，核苷酸同源性分别在95.9%～96.6%；与其他亚型的M片段同源性在85.5%～95.9%。

2.4 基于M片段的系统进化分析 用M片段G2区（2 003～2 302 nt）以 NJ法构建系统发生树，结果显示，此次测定的3个鼠肺标本所携带的汉坦病毒均属于汉城型S4基因亚型，与湖北和韩国的毒株亲缘关系较近，见图1。

Fig.1 Phylogenetic trees based on M partial sequences(G2 region)of M segment(2 003-2 302 nt)图1 基于M片段G2区（2 003～2 302 nt）的系统发生树

3 讨论

河南省曾是我国出血热的重发病省份，1981年曾暴发过家鼠型出血热疫情，我国第1株汉坦病毒也分离于此地［4-5］。由于大力开展有效的疾病防控，以及人民整体生活水平和卫生意识的提高，河南省的发病人数大幅下降；然而一些老的疫源地如确山县，宿主动物持续携带汉坦病毒，使该地区发病具有明显的时间和空间聚集性［6-7］。尽管近年来不断有新的汉坦病毒被发现，但我国目前流行的汉坦病毒仍然主要是汉滩型和汉城型［8-9］。既往研究认为，河南省疫区主要为家鼠型疫区，携带的病毒血清型为汉城型［10］。本次研究通过测序比对发现，河南省的主要流行型别仍为汉城型，2014年—2016年野外优势鼠种主要为褐家鼠，本次发现野外携带病毒的鼠种也为褐家鼠。居民区的优势鼠种每年有所不同，有褐家鼠、小家鼠和黄胸鼠［10］。本次发现居民区携带病毒的鼠种是小家鼠和大仓鼠。

汉坦病毒培养困难，传统的空斑减少中和实验常用于病毒分型，但时间周期长，技术难度高，生物安全等级也高，目前已逐渐被基因分型方法所取代。1994年，国际病毒分类委员会已对汉坦病毒基因组分型制定了标准：新的汉坦病毒至少有1个基因片段的核苷酸序列和其他已知序列的差异小于75%；汉坦病毒亚型，至少有1个基因片段的核苷酸序列和该型的其他病毒序列有5%～24%的差异；同一亚型，所有基因片段的核苷酸序列差异在5%以下。根据这一标准进行分型研究发现，基于M片段 G2 区（2 003～2 302 nt）构建的进化树，基因分型与血清分型结果一致，因而常用来进行系统进化和分型研究［11-12］。2002年，河南省曾进行过汉城型病毒基因亚型和分布的研究，发现河南省主要以S1和S3亚型为优势型别，而确山县均为S3亚型［10］。本次研究发现，确山县的优势亚型已变为S4亚型，与其相邻的湖北省流行的S4亚型同源性最高，可能与周边省份流行型别的进化与传播有关，且此次研究发现的S4亚型汉城型病毒在小家鼠、大仓鼠和褐家鼠3个鼠种中均有发现，宿主范围广泛，可能会造成疫源地的扩大，因而有必要采取加强病原监测、防鼠灭鼠、健康教育等综合性防控措施，从而有效地预防河南省肾综合征出血热的流行。

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（2017-04-08收稿 2017-04-28修回）

（本文编辑 胡小宁）

Pathogenic analysis of rat infected hantavirus in Henan province,2014-2016

DU Yan-hua,LI Yi,MA Hong,WANG Hai-feng,XU Bian-li,HUANG Xue-yong△
Henan Provincial Center for Disease Control and Prevention,Henan Key Laboratory of Pathogenic Organism,Zhengzhou 450016,China△

E-mail:hxyzzu@163.com

ObjectiveTo analyze the genotyping of hantavirus and investigate the pathogenic features of local rats in Henan province.MethodsA total of 600 rats captured in Queshan county,Zhumadian city from 2014-2016 were chosen to find out the major species and density.Rat lung specimens were detected by RT-PCR using partial M and S segment primers,then sequencing and phylogenetic analysis based on M segment(2 003-2 302 nt)were performed to analyze gene subtype and evolution.ResultsIn the field of Queshan county,major species were sewer rats and apodemus agrarius,and the average density of rats was 1.33%-1.83%.Sewer rats,mus musculus and apodemus agrarius were major species in the residential area,and the average density of rats was 1.36%-1.97%.Hantaviruses were detected by RT-PCR in three captured rats in 2014,and the species were mus musculus,cricetulus triton and sewer rats.Nucleotide homology similarity based M and S segment of three positive products was 100%.Phylogenetic analysis indicated the virus was belonged to S4 subgenotype of Seoul virus,which was similar with the strains in Korea and Hubei province,China.ConclusionThe virus from rats in Queshan county,Henan province is seoul virus,S4 subgenotype.It is necessary to take the relevant prevention and control measures to prevent hemorrhagic fever of renal syndrome because of wide host range.

hemorrhagic fever with renal syndrome;Hantann virus;genotype;Henan;etiology;phylogenetic analysis

R373.32

：A

10.11958/20170418

国家自然科学基金资助项目（81573204）；河南省科技创新人才计划（164100510008）

郑州，河南省疾病预防控制中心，河南省传染病病原生物重点实验室（邮编450016）

杜燕华（1981），女，硕士，副主任技师，主要从事传染病预防控制方面研究

△通讯作者 E-mail:hxyzzu@163.com