鼠李糖乳杆菌（H0107）冻干保护剂的优化

余萍，范翠翠

（汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司，沈阳110023）

鼠李糖乳杆菌（H0107）冻干保护剂的优化

余萍，范翠翠

（汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司，沈阳110023）

以鼠李糖乳杆菌为研究对象，研究冻干保护剂脱脂乳粉、麦芽糊精、海藻糖、葡聚糖及甘油对菌株冻干存活率的影响。在鉴定菌种的基础上，先后通过单因素实验和正交实验得出最佳冻干保护剂组合，并进行验证，此配方冻干存活率为96.38%，根据配方的组成阐述冻干保护机理。

鼠李糖乳杆菌；冻干保护剂；存活率

0 引言

鼠李糖乳杆菌是由Sherwood Gorbach和Barry Goldin发现的一种益生菌，并命名[1]，LGG可以影响有害菌在肠道中的定植与克隆，同时还可以通过吸附和利用体内的毒素作为营养源，从而起到减少毒素对机体的影响[2]，提高免疫力等作用。LGG在保存和加工过程为了保持其活力，通常利用冷冻干燥技术来去除菌体中的水分，降低菌体的新陈代谢，从而达到保存的目的。但是在冻干的过程中，由于水分子结晶会受到蛋白质变性或是细胞代谢调节作用的损伤[3]。为了保护菌体，在冻干时会加入保护剂。由于不同菌种的代谢情况和抗冷冻能力不同，因此保护剂的成分以及各成分的含量就非常重要[4]。本实验以鼠李糖乳杆菌H0107为研究对象，经鉴定后利用单因素和正交实验得出LGG的最佳保护剂配方。

1 实验

1.1 MRS培养基

将蛋白胨10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温-80为1.0 mL，K2HPO4·7H2O为2.0 g，醋酸钠·3H2O为5.0 g，柠檬酸三铵2.0 g，MgSO4· 7H2O为0.2 g，MnSO4·4H2O为0.05 g，琼脂粉15.0 g加入1 000 mL蒸馏水中，加热溶解，待温度下降到25℃后用浓度为0.1 mol/L的盐酸和浓度为0.1 mol/L的NaOH调节pH值至6.2，并分装，在121℃下高压灭菌15 min备用。

1.2 菌泥的制备

鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus，GG，LGG）H0107来源于汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司实验室菌种库。配制MRS基础培养基60 mL，将培养基加入玻璃试管中，每只10 mL，灭菌后于37℃培养24 h，再按2%的量接种活化3代对数期的菌种，所得菌种在转速为6 000 r/min[5]（10℃）条件下离心10 min，去除上清液，得到鼠李糖乳杆菌菌泥。

1.3 方法

1.3.1 菌种鉴定

方法见GB 478935-2010对鼠李糖乳杆菌的形态及糖发酵能力进行鉴定。

1.3.2 冷冻干燥菌粉的制备与活菌计数

将保护剂按照要求用无菌水配置好，用浓度为0.1 mol/L盐酸将pH值调至7.2后在115℃（30 min）的条件下进行灭菌，灭菌结束后，待温度冷却至20℃以下才可使用。将制备好的菌泥与保护剂混合，混合比例为1∶1（质量比），制成10 mL菌悬液，先在-25℃下与冷冻24 h，后逐步升温，每次提升5℃，直至30℃，当菌粉含水量小于2%冻干完成。冻干后的菌粉需在25℃以下，湿度小于50%的环境中收集，将得到菌粉用无菌袋密封好，用橡胶锤将大块敲碎；粉碎机进行间歇式细粉，粉碎后过100目筛，封存于冰柜中。

将得到的菌粉与10 mL生理盐水混合，搅拌成菌悬液后进行稀释涂布并培养，根据菌落总数确定冻干数量，来计算冻干存活率，平行三次实验[6]。

1.4.2 冻干保护剂单因素实验

选用5种保护剂，分别为脱脂乳粉（1%，5%，10%，15%，18%）；麦芽糊精（1%，2%，4%，8%，10%）；海藻糖（3%，4%，5%，7%，9%）；甘油（0.2%，0.5%，1.0%，1.2%，1.5%）；葡聚糖（1%，3%，4%，5%，7%）[7]。

1.4.3 正交试验

根据单因素实验结果选择各因素保护能力较好的浓度水平，并利用正交组合的方法优化保护剂的配比，并测得每个结果的活菌数量，计算存活率。

2 结果

2.1 菌种鉴定结果

经鉴定后结果如图1所示。图1中，此菌株为革兰氏阳性菌，菌体呈规则杆状，通常断裂成链状，无芽孢，在MRS培养基37℃培养48 h，菌落直径1～2 mm，表面光滑、中央有凸起或扁平的白色菌落、不透明、有光泽、质地软。由糖发酵实验可知，其对可利用七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖发酵而不可利用棉子糖发酵，是鼠李糖乳杆菌典型的生化反应特征，因此可以证明，本实验所用菌种为鼠李糖乳杆菌。

图1 菌种鉴定结果

2.2 单因素实验结果

由图2可以看出，脱脂乳粉质量分数为5%～15%时菌粉冻干存活率最高，麦芽糊精质量分数为2%～8%时效果最好，海藻糖质量分数为5%～9%时冻干结果最好，甘油质量分数为0.5%～1.2%时结果最好，葡聚糖几乎对菌体没有保护效果。

图2 五种保护剂冻干效果

为了更好的保证菌体的存活率，一般选择几种保护剂进行复配。本实验中我们选择单因素实验中结果较好的保护剂分别为麦芽糊精、海藻糖、甘油以及脱脂乳粉进行接下来的正交实验，正交实验的因素水平如表1所示。

表1 因素与水平

表2为正交实验结果。由表2可以看出，各因素对鼠李糖乳杆菌H0107冻干效果影响顺序为C＞D＞A＞B，即海藻糖＞甘油＞脱脂奶粉＞麦芽糊精，得到最佳的冻干保护剂配方为脱脂乳粉10%，麦芽糊精4%，海藻糖7%，甘油1%（均为质量分数）；以此条件进行验证实验，活菌存活率为96.38%，保护效果最好。

表2 鼠李糖乳杆菌H0107冻干保护剂正交组合优化结果

3 讨论

糖和醇在冻干过程中可以保护菌体是因为其具有多个羟基，随着温度的下降，这些羟基代替了水分子与细胞膜中的磷酸基团形成氢键[8]，一方面减小了机械损伤，另一方面增大了空间，使磷脂之间不产生空间结构变化引起细胞死亡[9]，同时利用同样的原理，糖和醇与蛋白质结合，保证了蛋白质原有的结构和功能[10]。脱脂乳粉中含有的蛋白质可以作为大分子保护剂来保证菌类的存活率，其主要是吸附在菌类的细胞壁外，通过提高溶液的粘度，在冻干过程中会形成不规则的网状空间[11]，从而减小了菌体的机械损伤，大分子保护剂还可以促进低分子保护剂发挥作用。

海藻糖本身具有稳定生物膜和蛋白质的作用，被当做保存剂广泛应用于生物、医学和食品领域，从结构来看，每个海藻糖分子含有8个羟基[12]，同时每个甘油分子中含有3个羟基，因此此配方可以为菌体提供大量的羟基，在冻干过程中保护菌体。另一方面，脱脂乳粉所提供的大量蛋白质可以很好的为具体提供中空的保护结构[13]。

[1]OBERHELMAN R A,CILMAN R H,SHEEN P,et al.A place-bo⁃controlled trail of Lactobacillus GG to prevent diarrhea in undernour⁃ished Peruvian children[J].International Journal of Food microbiolo⁃gy,1999,134(1):15-20.

[2]CAROLYN A H，HANI S E.Surface binding of Aflatoxin B1 by Lac⁃tic acid bacteria[J].Appl Environment Microbiol,2006,67:3086-3091. [3]HANSEN E B.Commercial bacterial starter cultures for fermented foods of the future[J].International Journal of Food Microbiology, 2002,78(1):119-131.

[4]HAN B,BISCHOF J C.Direct cell injury associated with eutectic crys⁃tallization during freezing[J].Cryobiology 2004,48(1):8-21.

[5]杜鹏,刘芳,霍贵成.离心条件对双歧杆菌存活力的影响[J].山东大学学报(理学版),2008,43(7):40-43.

[6]林加涵,魏文铃,彭宣宪.现代生物学实验(下册)[M].北京:高等教育出版社,施普林格出版社,2001:34-36.

[7]张菊,李伟,李金敏,等.功能性低聚糖作为益生菌冻干保护剂的研究进展及其在畜牧生产中的应用[J].中国畜牧杂志,2012,48(24):56-59. [8]蒲丽丽，乳酸菌冻干保护剂及保护机理的研究进展，现代食品科技, 2005，01-0147-048.

[9]CARVALHO A S,SILVA J,HO P,et al.Protective effect of sorbitol and monosodium glutamate during storage of freeze-dried lactic acid bacteria.Le Lait,2003,83:203–210.

[10]EFIUVWEVWERE B J O,GORRIS L G M,SMID E J,et al.Man⁃nitol-enhanced survival of Lactococcus lactis subjected to drying[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,1999,51(1):100–104.

[11]洪庆涛.细胞培养液乳酸脱氢酶漏出率的比色测定及其应用.细胞生物学杂志,2004,26(1):89-92.

[12]张玉华,孟一,凌沛学,等.海藻糖和透明质酸对冻干双歧杆菌细胞的保护作用[J].食品科学,2010,31(7):236-241.

[13]王磊.嗜酸乳杆菌高密度培养及冻干保护剂的研究[D].西安:陕西科技大学,2011.

Optimization for cryoprotectant of Lactobacillus rhamnosus H0107

YU Ping,FAN Cuicui
（Han's(Shenyang)children's products Co.Ltd.，Shenyang 110023，China）

Lactobacillus rhamnosus is as the research object in this experimenta.Study on five cryoprotectors of freeze-dried survival strains, which are skimmed milk powder,malt,trehalose,glucan and glycerol.First we identified strains,then got the best combination of freeze dry⁃ing protective agents with single factor experiment and orthogonal experiment.Verified with experiment,survival rate of this formula of freeze drying protective agent is 96.38%.At last,this paper explains the protective mechanism of freeze drying according this formula.

Lactobacillus rhamnosus;freeze drying protective agent;survival rate

Q93-335

A

1001-2230（2017）05-0014-03

2016-10-31

余萍（1982-），女，硕士研究生，从事食品营养与益生菌方面的研究。