生鲜牛乳中抗生素残留检测技术研究进展

李丹妮，贡松松，顾欣，吴剑平，严凤，潘娟，张婧

(1.上海市动物疫病预防控制中心，上海201103；2.上海药明康德新药开发有限公司，上海200131)

生鲜牛乳中抗生素残留检测技术研究进展

李丹妮1，贡松松2，顾欣1，吴剑平1，严凤1，潘娟1，张婧1

(1.上海市动物疫病预防控制中心，上海201103；2.上海药明康德新药开发有限公司，上海200131)

对生鲜牛乳中抗生素残留的来源、危害、最高残留限量、残留的检测方法以及样品前处理新方法进行了综述，为开发抗生素多残留筛查方法以及建立样品通用前处理技术提供参考。

生鲜牛乳；抗生素残留；最高残留限量；检测方法；前处理技术

0 引言

食品安全是关系国计民生的重大问题，其中牛乳中抗生素残留问题又尤为突出。欧盟2377/90/EC已对兽药残留限量进行规定[1]，我国也也有相关规定[2]。抗生素在兽医临诊和畜牧生产中均有大量应用，但有部分抗生素被违法滥用于饲料添加剂中[3]生鲜牛乳中抗生素残留问题已经对乳品的安全造成了威胁[4]。据报道[5]，市售生鲜牛乳中，抗生素残留超标率达20%以上的药物有8种。对我国西宁、南宁、北京等大城市乳制品质量调查[6]结果显示，抗生素残留超标居不合格项目第一位。因此开发牛乳中抗生素多残留筛查的方法，已成为迫切需求。本文综述了生鲜牛乳中抗生素残留的来源、危害、最高残留限量、残留检测方法以及样品前处理策略。

1 生鲜牛乳中抗生素残留来源的多样性

牛乳中抗生素的来源较多，途径复杂。一般认为，对泌乳牛用药不当或不注意休药期是牛乳中抗生素残留的重要因素，尤其是使用乳房灌注法治疗乳腺炎时，易造成牛乳中抗生素的残留。另外，把抗生素作为奶牛饲料添加剂使用，也是一个重要原因。其次，使用未经彻底清洗和消毒的挤奶工具和贮奶用具也会造成抗生素残留问题。此外，还有一些不法交奶户在牛奶中加入抗生素防止牛奶酸败等等[7-9]。

2 生鲜牛乳中抗生素残留的危害

抗生素对于治疗和减轻人类和动物的疾病，起到了巨大的作用。在奶牛饲养过程中，对于提高牛奶产量方面也做出了相当大的贡献，很重要的原因是抗生素可以很好的防治奶牛的乳腺炎。但牛奶中残留的抗生素对人体具有潜在的危害和毒副作用[10-15]，其饮用对象包括了婴幼儿、青少年、老年人及孕期妇女，此类消费群体对牛乳中抗生素残留的耐受性较弱，会对其身体健康造成更严重的威胁，比如：青霉素、四环素、磺胺类药物均有一定抗原性，容易引起过敏反应；牛奶中残留的抗生素会诱导人体产生耐药性菌株，耐药细菌可延长感染病人的住院时间，加重病人的经济负担，缩短抗菌药物的使用寿命，加大感染者的死亡危险性，造成疾病流行绵延不断；牛奶中的抗生素会造成人体内菌群平衡紊乱，菌群失调，降低人的免疫力；在生产发酵类乳制品，如酸奶的发酵生产中，牛奶中的抗生素可阻止发酵的正常进行，影响奶制品品质，降低产量和质量，给生产企业造成巨大的经济损失；排泄到环境中的某些抗生素会污染环境等。

3 生鲜牛乳中抗生素的最高残留限量

欧盟对兽药中抗生素的使用有严格的规定，通过发布一些条例和指令用于监管，欧盟已从1998年起全面禁止人用抗生素用于饲料[16]。欧盟委员会指令96/ 23/EC[17]是对动物产品监控和检测的重要法规性文件。该指令将需要监测的兽药分为A、B两组，其中B类包括各类抗生素（如磺胺和喹诺酮类等）。

日本“肯定列表制度”对食品中农业化学品残留限量的要求更加全面、严格[18]。其主要内容包括暂定标准和一律标准。暂定标准即是对当前通用农药、兽药和饲料添加剂都设定新的残留限量标准；一律标准指对尚不能确定“暂定标准”的农药、兽药及饲料添加剂都设定为10 μg/kg的统一标准。

我国农业部先后颁布了176号、193号、235号公告[2,19-20]。176号公布了5类40种禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种，包括各种抗生素残渣。抗生素残渣是抗生素类产品生产过程中产生的工业三废，因含有微量抗生素成分，在饲料和饲养过程中使用后对动物有一定的促生长作用，但存在一定的安全隐患。193号公告《禁用清单》中增加了氯霉素及其盐、酯等。235公告对β-内酰胺类、四环素类等抗生素规定了明确的残留限量。表1汇总了欧盟、日本以及中国在牛奶中的最高残留限量（MRL）的部分实例。

4 生鲜牛乳中抗生素残留检测方法研究进展

4.1 理化检测法

4.1.1 薄层色谱法

薄层色谱法（TLC）是从经典柱色谱法和纸色谱法基础上发展起来的一种色谱技术。其原理是将要分离的牛奶或奶制品点在用固定相均匀涂布的薄板下端，然后将薄板斜插在盛有溶剂的层析缸中，使溶剂进入一部分固定相。由于毛细作用，被分离组分随展开剂以不同速度向上移动。由于固定相对混合试样中各组分的吸附力大小不同，各组分会选择性地保留在原点和展开剂前沿之间的固定相上，取出层析板晾干，用显色剂与分离组分反应显出有色(或荧光)斑点[21]。薄层色谱设备简单，选择性较好，但样品处理繁琐，灵敏度低，显色过程复杂，当前已很少使用。

4.1.2 毛细管电泳法

毛细管电泳法（CE）是将已注入缓冲溶液的毛细管柱插入处于同一水平的两个缓冲液槽中。在高压直流电场的作用下，带电溶质便朝与其极性相反的电极方向移动，从而实现分离的电泳分析方法。该法取样量少，节省成本，对分析成分的提取等步骤没有严格的要求，但必须采取有效地浓缩操作，以使其可在低浓度范围内检出。田春秋等[22]建立了同时检测牛奶4种青霉素类抗生素的高效毛细管电泳法。利用正交试验对缓冲液离子浓度和pH值等进行了优化，该方法对残留水平在1.56～100 mg/L的药物能在4.5 min内快速准确检出。

4.1.3 超临界流体色谱法

表1 欧盟、日本以及中国在牛奶中抗生素的最高残留限量（MRL）举例μg/kg

超临界流体色谱（SFC）是以超临界流体作为流动相的色谱法，其可作为液相色谱(LC)和气相色谱(GC)的补充。超临界流体具有特殊的热力学和流体力学性质，当用作流动相时，分离效率可比LC高。由于操作温度较低，可分析GC不能分析的热不稳定化合物。Danaher等[23]建立了一个多残留检测的超临界流体二氧化碳方法，可以提取动物肝脏中残留的10种苯并咪唑类药物。结果表明，该方法各种苯并咪唑的平均回收率介于51%和115%之间，该测定方法的定量限是50 μg/kg。

4.2 生物检测法

4.2.1 微生物检测法

微生物检测法是应用较广泛的方法，其测定原理是根据抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用，定性或定量检测样品中抗生素的残留。比如TTC法（氯化三苯基四唑氮法）、BSDA法（嗜热脂肪芽孢杆菌纸片法）、PD法（纸片法）及STOP法（拭子法）等[24]。传统的微生物检测法优点是检测费用低，缺点是检测时间长，显色状态判断通过肉眼辨别，易产生误差，且操作复杂。其中，纸片法和TTC法是牛奶中药物残留检测的两种常用的微生物检测法。常用的纸片法有枯草杆菌纸片法和嗜热脂肪杆菌纸片法，主要用来检测牛奶中的β-内酰胺类抗生素。纸片法定性准确，灵敏度高，氯霉素最低检出量10 μg/kg，土霉素50 μg/kg，链霉素1 000 μg/kg，红霉素50 μg/kg，青霉素2.5 μg/kg。TTC法是目前我国食品卫生标准中规定的检查生鲜牛乳中抗生素残留的检测方法(GB4789.27-2008)。微生物法结果可靠，成本较低，耗时较长，显色状态需肉眼判别。

4.2.2 免疫分析法

免疫分析法是以抗原或半抗原和抗体特异性结合为抗原-抗体复合物的免疫反应为基础的生化测试技术。目前药物残留免疫分析技术主要分为两大类：一为相对独立的分析方法，即免疫测定法(Immunoas⁃says,IAs)，如放射免疫标记技术(Radioimmunoassay, RIA)、酶联免疫法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)等；二是将免疫分析技术与常规理化分析技术联用，如利用免疫分析的高选择性作为理化测定技术中的净化手段，典型的方式为免疫亲合色谱(Immunoaffinity Chromatogrphy,IAC)。与常规的理化分析技术相比，免疫分析技术专一性强，灵敏度高。可达到ng/g～pg/g级，分析效率则为HPLC或GC的几十倍以上[7]。目前大部分抗生素已经建立了免疫测定法，包括磺胺类、氯霉素类、喹诺酮类以及四环素类等[14]。ELISA是目前奶牛场和牛奶公司使用最广泛、快速、灵敏的检测抗生素残留的方法。一般可进行40个以上样品的同时监测，检测通量高且成本较低，易于操作，可作为检测抗生素残留的快速筛查方法。但ELISA法也存在一些缺陷，如往往只能针对一种或一类抗生素，对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应，分析分子量很小或很不稳定的化合物有一定的困难。因此，如果通过ELISA法筛查出阳性样品，应再用其他仪器方法进行定性和定量确证，以避免假阳性实验结果。

4.2.3 生物传感器

生物传感器是对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。它利用生物化学和电化学原理，将生化反应信号转换为电信号，再通过放大和模数转换，测量出被测物质及其浓度。Gustavsson等[25]开发了一种基于羧肽酶活性的抑制反应检测牛奶中青霉素G残留的生物传感器。具有活性的、完整的β-内酰胺类抗生素的结构可与受体蛋白形成稳定的复合物，抑制酶活，从而通过酶活的降低测定青霉素的含量。结果表明，青霉素G的检测限为2.6 μg/kg，低于欧盟的MRL:4 μg/kg。还有报道[26]，将乳酸菌脱氢酶用作生物传感器的灵敏元件检测牛乳中青霉素的含量，检测灵敏度可达100 μg/kg。生物传感器技术选择型好，灵敏度高，分析速度快。但仍面临一些困难：信号检测器的使用寿命不长，生物响应的稳定性和生物传感器的便携式问题等。

4.2.4 蛋白芯片技术

蛋白质芯片是在基因芯片之后发展起来的一种高通量的蛋白功能分析技术，又称蛋白质微阵列。其原理是在固相支持物表面高密度排列蛋白质探针，可特异地捕获样品中分子，然后用CCD相机或激光扫描系统获取信息，最后用计算机进行定性定量分析。优点是样品用量少，高通量和检测速度快，该方法在抗生素检测领域有巨大潜力。Knecht等[27]开发了一种利用三甲氧基硅烷制备的抗原点阵，可同时检测牛奶中的β-内酰胺类和磺胺类等10种抗生素含量。整个检测高度自动化，每种样品的检测时间不到5 min。结果表明，除青霉素G接近于MRL，其它抗生素的检测限均远远低于MRLs，检测范围为0.12～32 μg/L。

4.3 联用技术

各种分析技术的联用是现代兽药残留分析的趋势，如薄层色谱-质谱法(TLC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、毛细管电泳-质谱法(CE-MS)、液相色谱-核磁共振法(LC-NMR)、超临界流体-质谱法(SFC-MS)等。随着色谱技术的不断发展，特别是与串联质谱（MS/MS）的联用，目前已广泛应用于兽药的多残留筛查[28-36]。因LC-MS/MS高效液相色谱-串联质谱对简单样品可进行分析前净化并具有几乎通用的多残留分析能力，可准确定性定量复杂混合物的组分，是一种高通量、高效率、高可靠性的分析技术。表2列举了近年来国际上关于牛乳中抗生素检测的LC-MS方法的实例。从表中可以看出，液相色谱与串联质谱联用是用于牛乳中兽药残留分析的首选方法，常用的前处理方法是乙腈沉淀蛋白和固相萃取(SPE)净化。

表2 关于抗生素等药物残留的LC-MS方法

近年来，国际上又出现了由LC-MS/MS向精确质量和全扫描技术转移的研究倾向，如LC-TOF-MS。利用液相色谱与飞行时间质谱的优势，在牛乳中兽药残留检测方面，已有多篇研究发表[10,37-38]。其优势明显，可在单次分析中同时筛选数百上千种不同化合物，结合精确分子质量数、保留时间、同位素丰度和二级特征碎片离子对目标化合物进行快速筛查与确证，在多残留筛查领域潜力巨大。Stolker等[37]建立了用TOF筛查兽药残留的方法，样品制备时放弃了超滤装置，而用SPE，结果显示，基质效应比超滤更低。Tur⁃nipseed等[38]也利用四级杆飞行时间液相色谱质谱法分析牛奶中的兽药和代谢物，牛乳样品用乙腈提取，净化步骤经过超滤膜处理，除去了SPE步骤，结果显示在97%的时间里可检出药物残留，加快了提取液的制备，提高了样品处理量。表3总结了关于牛乳中抗生素残留分析的LC-TOF-MS方法。

5 样品前处理方法研究进展

当前，就抗生素残留的危害和引起的争议而言，抗生素的残留已经成为迫切需要解决的问题。虽然色谱质谱的联用提高了残留的分析的灵敏度，检测性能杰出，但即使是飞行时间质谱，仍有局限性，通用的样品前处理方法的建立是亟待解决的问题。目前，样品处理的新趋势有如下特点：更少的样品量；减少或不用有机试剂；多种类化合物的通用提取方法以及自动化、高通量处理可能性[39]。其中，QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe）方法是近年来用于农产品检测的快速样品前处理技术，是基于分散固相萃取建立起来的一种分析方法，在农药和兽药残留领域获得了大量的应用[40-42]。表4总结了近年来关于样品制备的方法。

6 结语

综上所述，由于对奶牛的不恰当给药等因素，抗生素类药物的残留对人体健康有较大危害。通过比较各国和国际组织的相关标准与法规，应重视与加强检测与管理工作，利用高效、高灵敏度的联用技术，如LC-MS/MS、Q-TOF LC-MS等，开发牛乳中抗生素多残留筛查的方法，建立多残留检测样品的通用前处理技术，是我们今后的发展方向。

表3 关于抗生素等药物残留的TOF-MS方法

表4 关于样品制备的方法

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Research on the progress of the detection technology of antibiotic residues in raw milk

LI Danni1,GONG Songsong2,GU Xin1,WU Jianping1,YAN Feng1,PAN Juan1,ZHANG Jing1
(1.Shanghai Animal Disease Control Center,Shanghai 201103,China;2.WuXi AppTec,Shanghai 200131,China)

In this paper,the sources,hazards,maximum residue limits,residual detection methods and new methods of sample pretreatment of antibiotic residues in raw milk are reviewed,which may be expected to serve as references for developing antibiotic multi-residue screen⁃ing methods and establishing generic sample processing techniques.

raw milk;antibiotic residue;maximum residue limits;detection methods;pretreatment technology

TS252.7

B

1001-2230（2017）05-0038-05

2016-09-13

上海市科技兴农重点攻关项目[沪农科攻字（2016）第4-5号]。

李丹妮（1978-），女，高级畜牧师，研究方向为动物性产品中药物残留检测。

顾欣