副干酪乳杆菌水牛奶酸奶品质及其通便功能的评价

刘敏，潘红梅，吴志霜，王松梅，冯月梅，殷建忠，吴少雄

（昆明医科大学公共卫生学院营养与食品科学系，昆明650500）

副干酪乳杆菌水牛奶酸奶品质及其通便功能的评价

刘敏，潘红梅，吴志霜，王松梅，冯月梅，殷建忠，吴少雄

（昆明医科大学公共卫生学院营养与食品科学系，昆明650500）

研究了含副干酪乳杆菌LYO 50 DCU-S的水牛奶酸奶品质及其润肠通便作用。实验对副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵的水牛奶酸奶在1、7、14、21 d的发酵过程中的活菌数、pH值、酸度、黏度、持水力、感官指标等分别进行测定，将其与保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵的水牛奶酸奶进行对比分析，探究了LYO 50 DCU-S是否可作为附属发酵剂应用到水牛奶酸奶生产中。将昆明种雄性小鼠分为空白组、模型组、对照组和3个副干酪乳杆菌给药组。使用复方地芬诺酯建立小鼠便秘模型，副干酪乳杆菌水牛奶酸奶给药7 d后，便秘小鼠首次排便时间缩短;连续15 d灌胃副干酪乳杆菌水牛奶酸奶后,便秘小鼠墨汁推进率显著增加。结果表明，将副干酪乳杆菌LYO 50 DCU-S作为附属菌应用到水牛奶酸奶生产中具有可行性,副干酪乳杆菌LYO 50 DCU-S可显著改善水牛奶酸奶的润肠通便功能。

副干酪乳杆菌LYO 50 DCU-S；发酵剂；通便

0 引言

水牛奶是制作奶制品的良好来源，在水牛奶的产品加工中，以酸奶的加工最具价值。副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei,LP）是益生菌中干酪乳杆菌(Lac⁃tobacillus casei)的一个亚种，具有调节肠道微生态平衡等生理功能[1-3]。它在肠道中通过代谢产生的乳酸，能有效抑制有害细菌的生长和繁殖，维持肠道的生态平衡和正常机能[4]；并能增加肠道的蠕动，具有润肠通便的作用[5]。由于其对宿主显著的益生功效，成为人们研究、开发和生产的焦点[6]。我国对副干酪乳杆菌水牛奶酸奶的开发研究尚未见报导。本研究利用副干酪乳杆菌与保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组合发酵制备成水牛奶酸奶，通过建立便秘小鼠模型评价其润肠通便功能，为益生菌酸奶通便作用的研究评价提供参考依据。

1 实验

1.1 材料

菌株与牛乳：副干酪乳杆菌LYO 50 DCU-S、嗜热链球菌(S.thermophilus)和保加利亚乳杆菌(L.Bulgari⁃cus)，水牛奶。

实验动物：昆明种雄性小鼠60只，7周龄，体质量18～22 g，SPF级。

培养基：MC（Modified Chalmers）培养基，MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基，MRS（Man Rogosa Sharpe）甘露醇琼脂培养基。

复方地芬诺酯片，活性碳粉，阿拉伯树胶粉。

1.2 仪器设备

超净工作台，高压蒸汽灭菌器，台式冷冻高速离心机，EL20数显pH计，NDJ-1旋转粘度计，隔水式培养箱，电子天平。

1.3 方法

1.3.1 水牛奶酸奶的制备

发酵剂制备：称取LYO 50 DCU-S，YO-MIX冻干发酵剂各1 g，分别投放于99 mL的灭菌脱脂乳中，摇匀，制成菌含量为1%的接种菌液[7]。

水牛奶全脂乳预热至60～75℃，40 MPa下均质，95℃杀菌5 min，冷却至42℃，接入发酵剂，分装压膜，于42℃下发酵至pH值达到4.5时停止发酵，转移至4℃冰箱中冷藏[8]。各发酵剂添加量的百分比以水牛奶全脂乳为基础计量，发酵剂接种情况如表1所示。

表1 发酵剂接种情况

1.3.2 水牛奶酸奶的微生物、理化及感官指标

分别在水牛奶酸奶样品冷藏期的第1，7，14，21 d取样，进行微生物和理化指标的测定；感官指标在水牛奶酸奶样品冷藏1 d后进行评定。

（1）微生物指标。采用涂布平板计数法测定微生物指标[9]，此处的微生物指标测定主要测定酸奶中的乳酸菌活菌数。取25 g(mL)酸奶样品，加入225 mL无菌生理盐水，10倍系列稀释，选择2～3个适宜稀释度，各以0.1 mL加入到MRS、MC、MRS甘露醇平板进行涂布。MRS平板厌氧培养总乳酸菌，MRS甘露醇平板和MC平板分别需氧培养副干酪乳杆菌和嗜热链球菌，培养温度36±1℃，培养时间48 h±2 h后，分别记各菌株的活菌数。乳酸菌总数减去嗜热链球菌与副干酪乳杆菌计数之和，即为保加利亚乳杆菌计数。

（2）理化指标

①pH值与滴定酸度测定。采用GB5413.34—2010的方法测定滴定酸度。数显pH计直接测定水牛奶酸奶样品的pH值。

②持水力。菌株持水力采用KEOGH[10]等研究方法。取水牛奶酸奶样品15 mL，离心（3 000 r/min，4℃，20 min）。收集上清液称重。按下列公式计算：

持水能力=（上清液质量/样品质量）×100%。

③自发乳清析出情况。水牛奶酸奶自4℃冰箱取出后，称酸奶质量（W1），而后将酸奶杯倾斜45°（10 s）内吸出表面的乳清，再称取酸奶的质量（W2）。酸奶杯与膜质量记为W0。自发乳清析出=（W1-W2）/（W1-W0）。

④黏度。将水牛奶酸奶样品于室温(25℃)下回复一段时间，用玻璃棒顺时针、逆时针各搅拌20下，使酸奶样品均匀，选用4号转子，转速100 r/min，测试时间20-30 s，待指针趋于稳定可进行读数，读数乘上系数表上的特定系数即为酸奶黏度。

（3）感官指标评定。由本实验室成员15人组成感官评定小组，并对评定小组成员进行感官分析方法的培训。评分标准采用百分制[11]。对酸奶样品的气味、口感、表观、以及粘稠度进行打分。评定标准参照表2所示。

表2 酸奶感官评定标准

1.3.3 动物实验

1.3.3.1 样品及溶液的制备

发酵乳冻干粉的制备：采用1.3.1的方法制备发酵乳。用冻干机将其水分抽干，制成发酵乳冻干粉。

墨汁的制备：准确称取阿拉伯树胶100 g，加水800 mL，煮沸至溶液透明，称取活性炭(粉状)50 g加至上述溶液中煮沸3次，待溶液凉后加水至1 000 mL，于4℃冰箱中保存，用前摇匀。

复方地芬诺酯混悬液（0.05 g/100 mL及0.025 g/ 100 mL）的配制：复方地芬诺酯片，每片含复方地芬诺酯2.5 mg，分别取20片（0.05 g/100 mL）、10片（0.025 g/100 mL）用研钵研碎呈粉末后加水至50 mL，临用前配制。

1.3.3.2 实验动物分组及处理

所有小鼠按体重进行随机分组。LYO 50 DCU-S发酵乳的给予剂量设定为3个组，每人（按60 kg体质量计）每日200 mL，相当于3.3 mL/（dkg），分别按人体推荐摄入量的5倍、10倍、30倍设计低、中、高三个剂量组，每天一次经口灌胃小鼠。另设空白对照组、模型对照组和普通发酵乳对照组。

实验前所有组别小鼠自由摄食饮水，适应性饲养一周后，按以下方式喂养：①空白对照组和模型对照组，均经口灌胃生理盐水；②普通发酵乳对照组，经口灌胃普通发酵乳；③低剂量组，经口灌胃低剂量含LYO 50 DCU-S发酵乳；④中剂量组，经口灌胃中剂量含LYO 50 DCU-S发酵乳；⑤高剂量组，经口灌胃高剂量含LYO 50 DCU-S发酵乳。小鼠每天上午喂食，动物体重每周记录一次。

1.3.3.3 小鼠排便实验[12]

给受试样品7 d后，各组小鼠禁食不禁水16 h。模型对照组、普通发酵乳对照组和3个剂量组小鼠灌胃给予复方地芬诺酯（10 mg/kg），空白组给予生理盐水。低、中、高剂量组及普通发酵乳对照组与墨汁等体积混合，给予复方地芬诺酯0.5 h后，空白组和模型对照组小鼠灌胃墨汁2 mL/kg,低、中、高剂量组及普通发酵乳对照组分别给予含受试样品的墨汁2 mL/kg，动物均单笼饲养，正常饮水进食。从灌胃墨汁开始，记录每只动物首次排黑便时间。

1.3.3.4 小肠推进实验[12]

给受试样品15 d后，各组小鼠禁食不禁水16 h。模型对照组、普通发酵乳对照组和3个剂量组小鼠给予复方地芬诺酯（5 mg/kg），空白组给予生理盐水。给复方地芬诺酯0.5 h后，低、中、高剂量组及普通发酵乳对照组分别给予含受试样品的墨汁2 mL/kg（样品剂量同1.3.3.3节小鼠排便实验），其他对照组灌胃2 mL/kg。25 min后用颈椎脱臼法处死小鼠。打开腹腔分离肠系膜，剪去上端自幽门，下端至回盲肠部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”。按下式计算墨汁推进率：

墨汁推进率=墨汁推进长度(cm)/小肠总长度(cm)×100%。

1.3.4 数据分析

采用SPSS 17.0软件进行数据统计处理，墨汁推进率需进行数据变换[6]。x=sin-1x式中：x为墨汁推进率，结果用百分数表示。在进行方差分析时，需先进行方差齐性检验，方差齐后，计算F值，F值＜F0.05，则各实验组均数间不存在显著差异；若F值≥F0.05，P≤0.05，表明各组均数之间存在显著性差异；组间差异比较采用t检验。

2 结果与讨论

2.1 微生物指标

两种酸奶样品在1，7，14，21 d活菌数检测，结果如表3所示。

由表3可以看出，经4℃冷藏21 d后，样品1中嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的活菌数与样品2相比差异不显著(P＞0.05)，表明在酸奶中添加副干酪乳杆菌LYO 50 DCU-S对商业发酵剂中的菌株生长无影响。副干酪乳杆菌LYO 50 DCU-S的活菌数随冷藏时间的延长而逐渐增加，在14 d时达到最大值7.65 mL-1（对数值），随后出现降低，在21 d时为7.54。表明此菌株在酸乳冷藏期间存活能力较强。

表3 水牛奶酸奶在冷藏期间的活菌数(x±s,n=3)

2.2 理化指标

2.2.1 pH值和酸度

由图1和图2可以看出，4℃冷藏21 d期间，两种水牛奶酸奶样品的pH值随储存时间的延长而逐渐降低，而滴定酸度逐渐增高。添加了L.paracasei LYO 50 DCU-S的酸奶样品中，其pH值和滴定酸度与商业发酵菌株酸乳相比在冷藏期间的差异不显著(P＞0.05)，可能是由于酸奶样品发酵时间较短(5 h)，L.paracasei LYO 50 DCU-S在乳中产酸能力较弱的原因，进而表明L.paracasei LYO 50 DCU-S对酸奶冷藏期间的pH值与滴定酸度没有显著影响。

图1 水牛奶酸奶在冷藏期间pH值变化情况

图2 水牛奶酸奶在冷藏期间酸度变化情况

2.2.2 持水力的变化

持水力是酸奶的重要理化指标之一，它的大小直接影响着酸奶的组织状态。酸奶持水性越好，在不破乳的情况下更能保持产品的风味和气味，使产品口感更佳。由图3可以看出，两组酸奶样品都表现出了较好的持水力，含有LYO 50 DCU-S的酸奶样品2和样品1差异不显著（P＞0.05）。

2.2.3 黏度和自发乳清析出率

由图4和图5可以看出，两组样品的黏度和自发乳清析出在1～14 d冷藏期间逐渐增加，14 d后趋于稳定。PATRICIA[13]等研究表明，一些产胞外多糖（EPS）的益生菌能提高酸奶的质地、增加黏度与凝胶强度、减少乳清析出；在本研究中，添加了LYO 50 DCU-S的酸奶样品的黏度在冷藏期一直都高于商业发酵菌株样品，可能是由于本研究所选用的LYO 50 DCU-S菌株在乳中产生了胞外多糖，进而提高了酸奶的黏度、减少乳清析出。

图3 水牛奶酸奶在冷藏期间持水力变化情况

图4 水牛奶酸奶在冷藏期间黏度变化

图5 水牛奶酸奶在冷藏期间自发乳清析出率的变化

2.3 感官评定

由表4可以看出，样品2感官综合评分高于样品1。添加了L.paracasei LYO 50 DCU-S酸奶样品较商业发酵菌株酸乳样品，其口感更加细腻、丝滑、黏稠、均匀，由于菌株的互相协同作用，添加了L.paracasei LYO 50 DCU-S酸奶样品的香气更加浓郁。

2.4 小鼠体体质量的变化

由表5可以看出，小鼠体重在实验期间的变化，实验在小鼠生理常态下进行，各剂量组与各对照组之间比较，不存在显著性差异（P＞0.05）,表明副干酪乳杆菌LYO 50 DCU-S和商业发酵菌株酸乳在实验过程中对雄性小鼠体质量没有影响。

2.5 小鼠排便和小肠推进实验结果

表4 两组酸奶样品感官评定综合得分(x±s,n=15)

于模型组（P＜0.01）。副干酪乳杆菌LYO 50 DCU-S酸乳各剂量组显著高于商业发酵菌株酸乳组（P＜0.05）。副干酪乳杆菌LYO 50 DCU-S、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵的水牛奶酸奶可以显著改善便秘小鼠的排便能力，能对抗复方地芬诺酯引起的肠抑制作用，恢复小鼠的肠推进能力，缩短小鼠首次排便时间，具有润肠通便作用。同时不同剂量组间还表现出了剂量效应，即随着灌胃剂量的增加，酸乳对便秘小鼠的通便作用也随之显著。

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表5 实验小鼠体质量变化(x±s,n=10)g

实验小鼠连续灌胃副干酪乳杆菌LYO 50 DCU-S和商业发酵菌株酸乳7 d后测定对便秘模型小鼠首次排黑便时间的影响，结果如表6所示。

表6 实验菌株酸乳对便秘模型小鼠排便指标的影响（x±s,n=10）

由表6可以看出，与空白组相比，模型组小鼠首次排黑便时间与其存在极显著差异（P＜0.01），表明便秘小鼠模型成立。副干酪乳杆菌LYO 50 DCU-S和商业发酵菌株酸乳灌胃7 d后，各剂量组首次排黑便时间与模型组存在显著性差异（P＜0.05），且各剂量组间存在极显著差异（P＜0.01）。模型组墨汁推进率极显著低于空白组（P＜0.01），表明墨汁推进实验小鼠便秘模型成立。副干酪乳杆菌LYO 50 DCU-S酸乳各剂量组和商业发酵菌株酸乳灌胃15 d后，其各自小鼠小肠墨汁推进率均极显著高于模型组（P＜0.01）。副干酪乳杆菌LYO 50 DCU-S酸乳各剂量组显著高于商业发酵菌株酸乳组（P＜0.05）。

3 结论

(1)副干酪乳杆菌LYO 50 DCU-S与商业酸奶发酵剂YO-MIX混合发酵制备水牛奶酸奶，在4℃冷藏21 d，LYO 50 DCU-S对酸奶样品的商业菌种活菌数、pH值、滴定酸度、持水力等均无不良影响（P＞0.05），且在酸乳中存活力较强；可提高酸奶样品的黏度，但差异不显著（P＞0.05）；同时添加LYO 50 DCU-S作为发酵剂可以提高水牛奶酸奶的感官品质。所以LYO 50 DCU-S可作为一种较好附属菌应用到酸奶生产中。

(2)副干酪乳杆菌LYO 50 DCU-S酸乳各剂量组和商业发酵菌株酸乳灌胃15 d后，其各自小鼠小肠墨汁推进率均极显著高

Assessment of the quality and laxative effect ofLactobacillus Paracaseiin buffalo milk yogurt

LIU Min,PAN Hongmei,WU Zhishuang,WANG Songmei,FENG Yuemei, YIN Jianzhong,WU Shaoxiong
(Department of Nutrition and Food Science,School of Public Health,Kunming Medical University,Kunming 650500, China)

This study was conducted to evaluate the Laxative effect of lactobacillus paracasei in buffalo milk yogurt and its quality.Lactobacil⁃lus paracasei,lactobacillus bulgaricus and thermophilic Streptococcus thermophilus were used to ferment buffalo milk.Viable bacteria counts, pH values,acidities,viscosities,sensory indices were tested and recorded in 1 d,7 d,14 d,21 d.In order to explore the improvement of the LYO 50 DCU-S used as a subsidiary starter in the production of milk yogurt,the lactobacillus paracasei,lactobacillus bulgaricus,thermophil⁃ic Streptococcus thermophiles fermented buffalo milk yogurt was compared with that by YO-MIX(lactobacillus bulgaricus and thermophilic Streptococcus thermophilus).Male Kunming mice were randomly divided into blank group,model control group,control group and three does groups.Constipation model was induced by means of compound diphenoxylate.After 7 days of administration of lactobacillus paracasei in buffalo milk yogurt,the averaged first defecation time of mice was shortened.After another 7 days,the ink propelling rate was significantly increased.The results indicate that the application of Lactobacillus paracasei LYO 50 DCU-S as a subsidiary bacteria in the production of buffalo milk yogurt is feasible,and strain LYO 50 DCU-S can notably improve the laxative effect in constipated mice.

Lactobacillus paracaseiLYO 50 DCU-S;fermentation agent;defecation

TS252.54

A

1001-2230（2017）05-0019-04

2016-09-06

云南省科技计划项目(2007C0047R)；云南公共卫生与疾病防控协同创新中心资助项目(2016YNPHXT07)。

刘敏（1989-），男，硕士，研究方向为食品营养与健康。

吴少雄