纳米ZnO叉指电极阻抗传感器用于细胞检测研究

崔传金，刘双，龚瑞昆，田景瑞，张晓晨

（华北理工大学a:电气工程学院;b:基础医学院，河北唐山063200）

纳米ZnO叉指电极阻抗传感器用于细胞检测研究

崔传金a，刘双a，龚瑞昆a，田景瑞b，张晓晨a

（华北理工大学a:电气工程学院;b:基础医学院，河北唐山063200）

新鲜牛奶中体细胞数是衡量牛奶品质的重要指标之一，实现其快速、准确、低成本检测意义重大。用电化学沉积法将纳米ZnO固定在微叉指金电极的表面，构建了一种纳米ZnO阻抗传感器，在1 MHz内用电化学工作站对传感器中不同细胞浓度的奶样进行检测研究。结果表明修饰前后的阻抗图谱变化明显，修饰后阻抗传感器明显提高了检测的精度和灵敏度，能正确区别0，1×105，3× 105，8×105，3.1×106mL-1的5个等级试验奶样；将传感器测试牛奶的体系用等效电路模型代替进行仿真研究，发现常相位角元件CPEC与牛奶中细胞的含量相关性最好，CPEC值可用作传感器检测牛奶体细胞的指标。

纳米ZnO；叉指电极；CPEC阻抗传感器；细胞检测

0 引言

牛奶是一种重要的食品，牛奶中体细胞数（somat⁃ic cell count，简称SCC)是评价新鲜牛奶质量和奶牛乳腺健康状况的重要标准之一[1]。大多数西方发达国家都制定了相应的含量标准[2]。因此，牛奶中体细胞数的快速检测非常重要。虽然，现在有多种检测牛奶体细胞的方法[2-3]，但是，准确、快速、便捷、低成本的检测方法仍需要进一步的研究。

针对以上问题，本文采用微加工和纳米技术构建了一种纳米ZnO叉指微阵列阻抗传感器，对不同细胞浓度的奶样进行了测试，并用等效电路模型进一步仿真研究了被测体系的阻抗组成，得到了一种快速、准确、便捷的检测牛奶体细胞含量的阻抗传感器。

1 实验

1.1 仪器与试剂

Gamry Reference 600电化学工作站，C1-20B离心机，KQ218型超声波清洗器，PHS-3EpH测量仪，DHG-9053A鼓风干燥箱，Olympus显微镜，TOMY SX-700高压锅，thermo 1300 SERIES A2超净工作台，二氧化碳细胞培养箱等。

六水硝酸锌（Zn(NO3)2·6H2O）AR，丙酮（CH3COCH3）AR，无水乙醇（CH3CH2OH）AR，氢氧化钾（KOH）AR，盐酸（HCl）AR，K562细胞株，RP⁃MI1640基础培养液，胎牛血清，双抗等。

1.2 传感器的构建

采用光刻剥离工艺制备叉指微阵列电极，如图1（a）所示，共26对叉指，指长7 950 μm，指宽50 μm，间距50 μm，厚度0.1 μm。按照图1（b）所示的工艺过程进行加工[4]，选择1 mm厚的石英玻璃作为传感器基底，将基底清洗、烘干，在其表层旋涂光刻胶，后按设计尺寸进行光刻，用整片浸没式显影技术显影出电极形貌并烘干；然后在显影好的电极上溅射铬层和金层，最后剥离成预期的电极。

图1 叉指电极的制作流程

本文采用阴极恒电位法[5]在金叉指电极表面沉积纳米ZnO薄膜，化学总反应式为

采用三电极系统制备纳米氧化锌，工作电极（WE）为金叉指电极，参比电极（RE）为饱和甘汞电极（SCE），辅助电极（CE）为锌片电极。首先将工作电极表面清洗干净，先用稀盐酸浸泡5 min，再依次用丙酮、无水乙醇、超纯水超声15 min，常温干燥后备用。配制浓度0.1 mol/mL的硝酸锌溶液40 mL为电解液，搅拌均匀后放入恒温烧杯中密封加热至75℃备用。并用稀盐酸和氢氧化钾溶液调节硝酸锌溶液的酸碱度至pH=5。将电极按照工作电极和辅助电极相对、且和参比电极相邻的位置固定，再与电化学工作站连接。设置沉积电位为-1.0 V，沉积时间为10 min，稳定2 min后开始沉积[6]。沉积好后传感器放入干燥箱内充分干燥，最后密封、避光保存。

1.3 测试实验

1.3.1 测试样品的准备

试验所用牛奶采自唐山市开平区正常生理期的同一头奶牛。将采集的新鲜牛奶放入灭菌后的孔隙为5 μm的干净砂芯过滤装置中过滤除去牛奶中的杂质和原有体细胞。试验用培养的K562细胞代替牛奶中的体细胞[7]，共配置5个浓度梯度的奶样如表1所示。

首先计算好每个浓度所用细胞个数，将用细胞计数板计数后的k562细胞悬液按照计算后的比例分成五份放在培养箱中备用（k562细胞17个小时分裂一次），每次测试试验之前再将分好的k562细胞悬浮溶液离心，去掉上清液，加入牛奶至5 mL，轻轻混匀后备用。为了保持细胞在牛奶中的活性，试验样品现配现测。

1.3.2 测试实验

传感器两端分别与电化学工作站的两条工作电极（W/WS）和辅助电极、参比电极（C/R））相连。取0.1 mL混匀的样品溶液均匀滴到传感器凹槽内，如图2所示。测试交流信号幅值为300 mV，测试频率为10Hz-1MHz，每个样品重复测量3次。

图2 传感器检测实物

2 结果分析与讨论

传感器修饰纳米氧化锌后，会在叉指电极传感器的表面会形成一层比较致密均匀的半导体纳米ZnO薄膜，如图3所示。由图3可以看出，在金的表面形成了相对比较均匀致密的纳米ZnO薄膜。用循环伏安法对传感器进行表征，并与修饰前的循环伏安图谱进行比较，如图4所示,图4中曲线1和曲线2分别是电极修饰前和修饰后的循环伏安曲线。由图4可以看出，修饰前氧化还原峰比较明显，在修饰了纳米ZnO后氧化还原峰急剧减小，表明电极表面形成的纳米ZnO已经比较紧密的贴附在了金电极的表面，在传感器表面制备了需要的纳米ZnO薄膜。

图3 纳米ZnO修饰的叉指电极传感器场发射扫描电子显微镜（FESEM）

图4 纳米ZnO修饰叉指电极前后的CV

用叉指电极传感器在修饰ZnO前后分别测试了表1中5个不同细胞浓度奶样得到了Bode图，如图5所示。图5（a）中，曲线束1和曲线束2分别是电极修饰纳米ZnO后和修饰纳米ZnO前传感器测取的阻抗曲线图。

由图5（a）可以看出，曲线1和2两束阻抗曲线在10Hz～1MHz的频率范围内，阻抗值都随频率值的增大而减小，这主要是由于叉指电极与牛奶间的界面电容随频率的变化引起的阻抗变化；从接近100 kHz时开始阻抗随频率的变化变得缓慢，并最终有保持在一定值的趋势，这主要是因为扫描频率增大到一定值后，牛奶的电阻逐渐成为阻抗的主导。另外，曲线1和2两束阻抗曲线从100 Hz开始分离趋势明显，频率越高阻抗差异越大，最后阻抗的差值保持在250 Ω左右，这主要是由电极表面的纳米ZnO薄膜及薄膜表面吸附的细胞等物质对电流的阻碍作用所致，与图4所示的循环伏安图谱结果相吻合。最后，图5（a）中1和2两束阻抗曲线的宽度不同，曲线1束阻抗图谱较宽，即，不同细胞浓度奶样的阻抗值差异大，这样就提高了传感器检测的灵敏度和精度。取图5（a）中曲线1的1 000～10 000Hz频段阻抗谱得到（b）图，（b）图中曲线1至5分别对应细胞含量从0～3.1×106mL-1的五个奶样，由图5（b）可以较清楚的看到奶样中细胞含量从低到高，对应样品的阻抗也从低到高，有较好的对应关系。

图5 不同细胞浓度奶样的Bode图

为了更好的分析牛奶的频谱响应特性，一般用电路模型对电极系统进行仿真研究[8]，文中用图6所示的等效电路来等效纳米ZnO叉指电极与牛奶组成的电极系统。

图6中CPED用来描述电极与牛奶间的双电层电容，由于存在“弥散效应”[9]因此用常相位角元件CPED（constant phase element）来等效描述，其阻抗可以用式（2）表示，即

式中：Z为阻抗，单位Ω；ω为角频率，单位Hz；Y0为CPED的参数，单位为Ω-1·cm-2·S-1；n为弥散系数，当n=1时，它就是等效电容。Rs为牛奶电阻；Ri为界面电阻，由电子传递电阻和扩散阻抗组成[10-11]。由于纳米ZnO增加了电极的表面积、其高等电点和良好的生物兼容性更容易在电极的表面吸附牛奶中的细胞。因此用CPEC来表示细胞和电极间形成的电容，Rc为细胞质电阻，是细胞内部的介质电阻。

图6 等效电路模型

用Gamry Reference 600自带的电路模型拟合软件对修饰前后阻抗实测数据进行仿真拟合，结果如图7所示。图7中，曲线1是电路模型对修饰后电极实验数据的拟合曲线束，曲线2是电路模型对修饰前电极实验数据的拟合曲线束。由图7可以看出，电路模型可以很好的对实验数据进行拟合；等效电路元件的仿真值如表1所示。

图7 等效电路与实验数据拟合结果

由表1可以看出，Rs在修饰后等效电阻有所增大，但随细胞浓度的变化规律性不强。Ri修饰前后变化相对较大，修饰后界面电阻变小，说明纳米ZnO在电化学反应中起到了加速电子传递的作用，使得电子传递电阻变小，但随细胞浓度的变化规律性不强。牛奶和电极间的相位角元件CPED在修饰后有增强的趋势，但其值随细胞浓度的变化规律性也不强。

CPEC的值在修饰前后变化较大，修饰前光滑的金电极表面对牛奶中大分子和细胞的吸附能力有限，牛奶中的体细胞和大分子蛋白质类物质主要悬浮在牛奶中，因此CPEC值较小。修饰纳米ZnO后，电极的表面积增加，纳米ZnO良好的生物兼容性和较高的等电点（9.5）使得电极表面很容易吸附体细胞和大分子蛋白质物质，使得电极与细胞之间形成的CPEC的值变大。在10 kHz的频率下CPEC的值与五个不同浓度细胞含量的关系如图8所示。由图8可以看出，牛奶中从无细胞到有细胞CPEC的值变化较大，主要是细胞与电极间形成电容的原因。浓度从1×105mL-1到8× 105mL-1有较好的线性关系，对回归曲线进行计算，检测阈值设为2%，如图9所示，决定系数R2为0.9602。细胞从8×105mL-1增加到3.1×106mL-1时CPEC值增加不大，可能是由于传感器表面达到饱和吸附状态所致。虽然在图9所示的细胞浓度区间内能够对样品进行正确的区分，但是检测的阈值较小，区分度不够好，可能主要是因为纳米ZnO对牛奶中体细胞的特异性吸附不强所致，被吸附到电极表面的还有其它的一些物质，如牛奶中的蛋白质、脂肪和无机盐等，这样就大大降低了细胞在传感器表面的附着率，使得细胞含量的决定性作用减弱。因此，要进一步提高检测细胞的灵敏度，应当增加细胞与传感器表面的特异性吸附。

表1 等效电路中各元件的仿真值

图8 10 kHz频率下传感器修饰后不同细胞浓度的CPEc值

图9 10 kHz频率下三个浓度测试样品的拟合曲线

3 结论

本文用微加工技术，加工了微型叉指电极传感器，并在传感器的表面进行了纳米ZnO的修饰，在1 MHz以内研究了传感器检测牛奶体细胞的频谱特性。用等效电路模型研究了被测体系的阻抗特性，发现常相位角元件CPEC与细胞含量的关系密切，在10 kHz频率下，在1×105mL-1到8×105mL-1的细胞浓度范围内有较好的线性关系。可作为一个检测细胞含量的重要指标，确定了纳米ZnO在提高传感器检测精度方面的重要作用。另外，通过分析可以预测对纳米ZnO表面进行特殊修饰，实现其表面对牛奶中体细胞的特异性吸附应该能够极大提高传感器的灵敏度。

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Research of Nano-ZnO interdigitated array microelectrodes impedance sensors for sell detection

CUI Chuanjina,LIU Shuanga,GONG Ruikuna,TIAN Jingruib,ZHANG Xiaochena
（North China University of Science and Technology a.College of Electrical engineering;b.School of Basic Medical Sci⁃ences,Tangshan 063200,China）

Somatic cell count of fresh milk is one of the important indexes for milk quality evaluation.It is significant to realize its fast,accu⁃rate and low cost detection.A Nano-ZnO impedance sensor was constructed by immobilizing the Nano-ZnO which is deposited by elec⁃trochemical method on the surface of the gold interdigitated Array Microelectrodes.Electrochemical workstation was used to test the cell con⁃centrations below the test frequency 1MHz.The results showed that the changes of the impedance spectra were obvious,the sensor modified with Nano-ZnO can improve the detection accuracy and sensitivity,the 5 test samples which are 0,1×105,3×105,8×105and 3.1×106mL can be correctly distinguished.The equivalent circuit model of the electrochemical cell was introduced for interpretation of the impedance com⁃ponents of the system,and found that CPEChas a strong correlation with the somatic cell count,and can be used as an index of the sensor to detect the somatic cell count in milk.

Nano-ZnO;interdigitated microelectrode;impedance sensor;cell detection

TS252.7

A

1001-2230（2017）05-0023-04

2016-07-05

河北省自然科学基金（青年）项目（F2015209308）资助；河北省教育厅项目（ZD2016070）资助；河北省食品药品监督管理局项目（QN2015012）资助。

崔传金（1982-），男，讲师，研究方向为生物检测技术与智能仪器。