血浆miR-192表达与丙泊酚全麻下肝脏肿瘤切除术肝损伤相关性研究

解康杰 凌志强 连燕虹 余江流 韩静 方军

血浆miR-192表达与丙泊酚全麻下肝脏肿瘤切除术肝损伤相关性研究

解康杰 凌志强 连燕虹 余江流 韩静 方军

目的 评估外周血miR-192表达与丙泊酚全麻下肝脏肿瘤切除术肝损伤的相关性，探讨循环血中miR-192可否作为肝脏肿瘤术后肝损伤的生物标志物。方法 选取行肝脏肿瘤择期手术的患者101例，记录患者一般状况、麻醉药物及麻醉方法，肿瘤大小、手术类型、是否肝门阻断、术中出血量，术后12～24h内患者的肝肾功能。术后第1天取外周血测定循环血中miR-192浓度。应用统计学方法分析循环血中miR-192水平与手术肝损伤的相关性。结果 术中出血量≥500ml的患者，术后ALT、AST、miR-192升高幅度显著高于出血量＜500ml的患者，差异有统计学意义（P=0.046、0.020、0.000）。有肝门阻断的患者，术后miR-192升高幅度显著高于无肝门阻断患者，差异有统计学意义（P=0.001）。miR-192与ALT、AST均呈正相关（r=0.930、0.744，P=0.000、0.000）。术中丙泊酚用量与术后ALT、AST、miR-192均呈正相关（r=0.231、0.248、0.232，P=0.020、0.012、0.020）。手术持续时间与术后ALT、AST、miR-192均呈正相关（r=0.184、0.241、0.185，P=0.011、0.001、0.011）。结论 血浆miR-192表达与丙泊酚全麻下肝脏肿瘤切除术肝损伤具有良好的相关性，miR-192可能对缺血性肝损伤和创伤性肝损伤较为敏感，可以作为肝脏肿瘤切除术肝损伤的标志物。

miR-192 丙泊酚 肝肿瘤切除术 肝损伤

肝脏肿瘤是常见的消化道恶性肿瘤，手术切除是肝脏肿瘤有效治疗方法之一[1]。肝脏肿瘤手术治疗过程中会伴随有麻醉药物肝毒性、出血、肝门阻断至缺血再灌注损伤、术中电刀烧灼伤及机械性损伤、炎症、内毒素血症等肝损伤并发症。目前评价肝损伤的丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）也有局限性，可出现假阳性或假阴性，如在肾损伤和骨骼肌损伤时也可检测到血清ALT升高，临床上很容易错过肝损伤最佳治疗时期。近年来循环血中microRNA有望成为肝损伤的生物标记物[2]。小鼠实验证明miR-122和miR-192评估药物性肝损伤灵敏度远高于ALT[3]。本研究通过检测外周血miR-192水平表达，评估其与丙泊酚全麻下肝肿瘤切除术后肝损伤的相关性，探讨循环血中miR-192可否作为肝脏肿瘤术后肝损伤的生物标志物，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集我院2011年5月至2012年7月择期行肝脏肿瘤切除手术的患者。排除标准：术前已经有严重肝功能损伤或肾功能损伤、同一次住院期间行第2次肝脏手术、存在影响生存的严重原发性疾病患者。共纳入研究101例患者，其中男79例（78.2%），女22例（21.8%）；年龄18～78岁，其中40～64岁患者84例（占83.2%）。体重过轻4例，正常体重72例（占71.3%），体重过重20例，肥胖5例。ASAⅠ级9例，Ⅱ级89例，Ⅲ级3例。本研究经医院伦理委员会同意，患者或其授权的家属签署书面同意书。

1.2 麻醉方法 麻醉采用全凭静脉全麻。患者入手术室后采用多参数监护仪（美国Datex-Ohmeda S/5）行心电图、血氧饱和度及无创血压连续监护；麻醉前完成有创桡动脉直接测压（美国ICUmedical公司）及右颈内静脉置管（德国B.Braun Certofix Duo V720）行中心静脉压力监测；连接脑电双频谱指数（bispectral index，BIS）监护仪（美国Aspect Vista公司）行术中持续镇静深度监测。全麻诱导采用咪达唑仑（江苏恩华药业股份有限公司，规格：5mg:5ml）0.05mg/kg、芬太尼（宜昌人福药业有限责任公司，规格：0.5mg:5ml）4μg/kg、丙泊酚（英国阿斯利康公司，规格：500mg:50ml）1.0～1.5mg/kg、罗库溴铵（美国默沙东公司，规格：50mg:5ml）0.08mg/kg，气管插管后采用间歇正压通气，潮气量为8～10ml/kg，呼吸频率10次/min，吸呼比1∶2，维持呼气末二氧化碳分压（PETCO2）在30～40mmHg。麻醉维持依据BIS及术中血流动力学变化采用丙泊酚6～10mg/（kg·h）、瑞芬太尼（宜昌人福药业有限责任公司，规格：1mg/瓶）0.1～0.3μg/（kg·h）、罗库溴铵0.04～0.08 mg/（kg·h）。维持术中收缩压的波动幅度不超过基础值25%。手术结束前30min停止给予肌松药，静脉注射芬太尼0.1mg。

1.3 观察指标 （1）术前一般资料：年龄、性别、ASA分级、BMI、术前血常规及肝肾功能、术前合并症、原发性还是转移性肝肿瘤。（2）记录术中肿瘤大小、是否肝门阻断、术中出血量。（3）记录术后12～24h内患者的肝肾功能。（4）术后第1天抽取外周血测定循环血中miR-192水平，miR-192测定水平除以20例正常人（随机选取本院职工健康体检血样，已经告知并签知情同意书）均值得出miR-192倍数，正常范围为0.5～2.0倍，低于0.5倍为下调，高于2.0倍为上调。

1.4 miR-192水平测定 （1）于手术结束后12～24h内用BD肝素锂真空采血管抽取静脉血5ml，贮存于4℃。在4℃下分别以1 200×g和12 000×g各离心10min。取250μl血浆置于无RNA/DNA酶的离心管中，并加入750μl的TRIzol LS（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA），混匀，室温静置5min后于-80℃低温保存。（2）血浆总RNA的提取：取已加入TRIzol LS的血浆，加入1pmol athmiR-159a（由中国锐博生物科技有限公司合成）使溶液充分混合。之后用TRIzol LS，参照miRNA分离试剂盒说明书中的步骤提取总RNA。提取的RNA沉淀重新悬浮于25μl不含核酸酶的水并储存在-80℃。（3）逆转录及定量PCR检测miR-192的表达：从重新悬浮总RNA 的25μl溶液中取3μl等分试样，使3μl总RNA聚腺苷酸化并使用试剂盒逆转录为cDNA（One Step Prime Script miRNA cDNA Synthesis kit，日本Takara公司）。随后，将cDNA稀释7.5倍，取2μl稀释的cDNA作为模板。最后，稀释的cDNA与miRNA的特异性引物、SYBR-Green Mix（Takara）在ABI 7500实时PCR系统（ABI PRISM）运行qRT-PCR。miRNA表达的循环阈值（Ct）的值标准化为ath-miR-159a（U6）。数据采用2-△△CT法分析miR-192表达的相对变化[3-4]。

1.5 统计学处理 应用SPSS 22.0统计软件。正态分布的计量资料以表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料组间比较采用Pearson χ2检验；等级资料比较采用Hruskal-Wallis H秩和检验。正态分布的双变量资料采用Pearson相关分析。

2 结果

2.1 肝脏肿瘤及手术状况 101例患者中合并乙肝65例（占64.4%）；原发性肝脏肿瘤有96例（占95.0%），转移性肝脏肿瘤5例；恶性肿瘤97例（占96.0%），良性肿瘤有4例；肿瘤＞5cm患者44例（占43.6%）。合并肝脏外其它系统的肿瘤9例。手术过程中未行肝门阻断患者31例（占30.7%），肝门阻断患者70例（占69.3%）。术中出血量＞500ml患者14例（占13.9%），有12例患者（11.9%）进行输血。

2.2 二分类变量术后miR-192、AST、ALT水平比较 男性患者术后第1天ALT和miR-192较女性患者明显升高，差异均有统计学意义（P=0.031、0.001）。术中出血量≥500ml的患者，术后ALT、AST、miR-192升高幅度显著高于出血量＜500ml的患者，差异均有统计学意义（P=0.046、0.020、0.003）。有肝门阻断的患者，术后miR-192术后升高幅度显著高于无肝门阻断患者，差异有统计学意义（P=0.035），详见表1。

表1 术后miR-192、AST、ALT水平比较

2.3 三分类变量术后miR-192、AST、ALT水平比较 不同年龄阶段、不同ASA分级的患者术后miR-192、AST、ALT水平的比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），详见表2。

2.4 miR-192与ALT、AST水平相关性分析 研究结果显示miR-192与ALT、AST水平均呈正相关（r= 0.930、0.744，P=0.000、0.000），表明miR-192可作为预测肝肿瘤手术肝损伤的标记物（见图1）。

2.5 术中丙泊酚用量、手术持续时间与术后ALT、AST、miR-192相关性分析 研究结果示术中丙泊酚用量与术后ALT、AST、miR-192水平均呈正相关（r=0.231、0.248、0.232，P=0.020、0.012、0.020）。手术持续时间与术后ALT、AST、miR-192均呈正相关（r=0.184、0.241、0.185，P=0.011、0.001、0.011）。但是如果控制时间因素做偏相关分析，丙泊酚与术后ALT、AST、miR-192无相关性。如果控制术中丙泊酚用量因素作偏相关分析，手术持续时间与术后ALT、AST、miR-192无相关性。详见图2-5。

3 讨论

miR-192是人体正常肾脏、肝脏及结肠组织中富含的一种miRNA，在结肠癌、肝癌、肺癌等肿瘤组织中表达降低，被认为是一种肿瘤抑制性miRNA[5-6]。小鼠实验证明miR-192评估药物性肝损伤敏感性远高于ALT，miR-192是评估肝损伤的有前途的生物标志物[3]。Roy 等[7]动物试验也认为miR-192-5p参与急性肝损伤期间肝细胞死亡的调节，并且可能代表肝损伤的有效标记物。本研究目的在于评估外周血中miR-192表达与丙泊酚全麻下肝癌切除术肝损伤的相关性，探讨循环血中miR-192可否作为肝癌术肝损伤的生物标志物。

本研究共纳入101例患者，男性显著多于女性，40岁以下的患者7例，40～64岁的患者84例，占83.2%，65岁及以上的患者10例，可以看出肝脏肿瘤多分布在40～64岁这个年龄段的人群中。男性患者组术后第1天ALT值和miR-192较女性患者明显升高，可能与肝癌患者男性所占百分比较高。另外性激素在肝癌发生和进展中有一定作用，男性在肝细胞性肝癌患者中占绝大多数，为女性的8倍多[8]。术中出血量≥500ml的患者，术后ALT、AST、miR-192升高幅度显著高于出血量＜500ml的患者，表明手术术中出血量对于术后肝功能有影响。有肝门阻断的患者，术后miR-192升高幅度显著高于无肝门阻断患者，差异有统计学意义，说明miR-192对缺血性肝损伤的灵敏度高于传统的肝损伤标记物。

表2 术后miR-192、AST、ALT水平比较

图1 miR-192与ALT及AST水平相关性分析

图2 丙泊酚用量与ALT及AST水平相关性分析

图3 丙泊酚用量与miR-192水平相关性分析

图4 手术持续时间与ALT、AST水平相关性分析

术中丙泊酚用量、手术持续时间与术后ALT、AST、miR-192具有相关性。但是如果控制时间因素做偏相关分析，丙泊酚与术后ALT、AST、miR-192无相关性。如果控制术中丙泊酚用量因素做偏相关分析，手术持续时间与术后ALT、AST、miR-192无相关性。所以术中丙泊酚用量与术后ALT、AST、miR-192的相关性可能是由于手术创伤大、时间长的肝脏手术术中丙泊酚用量相应增加有关。与丙泊酚本身对肝脏的作用是否有关尚需进一步研究证实。本结果可以间接说明miR-192与手术创伤大小具有一定的相关性。研究显示miR-192与ALT值具有良好的相关性，miR-192与AST值也有较好的相关性，表明miR-192可作为预测肝肿瘤术后肝损伤的生物学标记物。Krauskopf等[9]研究证明，血浆miR-192表达与药物诱导的肝损伤相关，miR-192可以作为评价药物性肝损伤及恢复的标记物。Nagano等[4]研究microRNA评估纳米材料诱导的肝损伤实验中也证明miR-192是良好的肝损伤标志物。Church等[10]动物研究认为miR-122-5p和miR-192-5p是良好表征的肝损伤标记物。本研究也证明miR-192可以作为评估手术创伤性肝损伤的标记物。

图5 手术持续时间与miR-192水平相关性分析

综上所述，本研究表明血浆miR-192表达与丙泊酚全麻下肝肿瘤切除术肝损伤具有良好相关性。miR-192可能对缺血性肝损伤和创伤性肝损伤较为敏感，可以作为肝肿瘤切除术肝损伤的标志物。

[1] Graf D,Vallbhmer D,Knoefel W T,et al.Multimodal treatment of hepatocellular carcinoma[J].European Journal of Internal Medicine,2014,25(5):430-437.

[2] Amacher D E,Schomaker S J,Aubrecht J.Development of blood biomarkers for drug-induced liver injury:an evaluation of their potential for risk assessment and diagnostics[J].Mol Diagn Ther, 2013,17(6):343-354.

[3] Wang K,Zhang S,Marzolf B,et al.Circulating microRNAs,potentialbiomarkers for drug-induced liver injury[J].Proc Natl Acad SciU S A,2009,106(11):4402-4407.

[4] Nagano T,Higashisaka K,Kunieda A,et al.Liver-specific microRNAs as biomarkers of nanomaterial-induced liver damage [J].Nanotechnology,2013,24(40):405102.

[5]Chung A C,Huang XR,Meng X,et al.miR-192 mediates TGF-beta/Smad3-driven renal fibrosis[J].J Am Soc Nephrol,2010,21 (8):1317-1325.

[6] Xie Q H,He XX,Chang Y,et al.MiR-192 inhibits nucleotide excision repair by targeting ERCC3 and ERCC4 in HepG2.2.15 cells [J].Biochem Biophys Res Commun,2011,410(3):440-445.

[7] Roy S,Benz F,Alder J,et al.Down-regulation of miR-192-5p protects from oxidative-stress induced-acute liver injury[J]. ClinicalScience,2016,130(14):1197-1207.

[8] Lam C M,Yong J L,Chan A O,et al.Better survival in female patients with hepatocellular carcinoma:oral contraceptive pills related?[J].J Clin Gastroenterol,2005,39(6):533-539.

[9] Krauskopf J,Caiment F,Claessen S M,et al.Application of High-Throughput Sequencing to Circulating microRNAs Reveals Novel Biomarkers for Drug-induced Liver Injury[J].Toxicol Sci, 2015,143(2):268-276.

[10] Church R J,Otieno MA,Mcduffie J E,et al.Beyond miR-122:I-dentification of MicroRNA Alterations in Blood During a Time Course of Hepatobiliary Injury and Biliary Hyperplasia in Rats[J]. ToxicologicalSciences,2016,150(1):3-14.

Correlation between plasma miR-192 expression and liver injury after liver resection under general anesthesia with propofol

XIE Kangjie,LING Zhiqiang,LIAN Yanhong,et al.Department of Anesthesiology,Zhejiang Caner Hospital,Hangzhou 310022,China

miR-192 PropofolLiver cancer resection Liver injury

2016-05-27）

（本文编辑：严玮雯）

浙江省医药卫生科技计划项目一般研究计划（2010KYA038）

310022 杭州，浙江省肿瘤医院麻醉科（解康杰、连燕虹、方军），浙江省肿瘤研究所（凌志强、余江流、韩静）

方军，E-mail：fangjunok@126.com

【 Abstract】 Objective To evaluate the relationship between miR-192 expression and hepatic injury after liver tumor resection under general anesthesia with propofol. Methods One hundred and one patients who underwent elective liver tumor resection were enrolled in the study.The general condition,anesthetic drugs,anesthesia methods,tumor size,operation type, portal triad clamping,intraoperative blood loss were recorded.The liver and kidney functions of the patients were measured 12－24 hours after operation.The concentration of miR-192 in peripheral blood was measured on the first day after operation.The correlation between miR-192 in circulating blood and postoperative liver injury was analyzed. Results Postoperative ALT,AST, miR-192 levels was significantly higher in patients with intraoperative blood loss≥500ml than those in patients with blood loss＜500ml(P=0.046,0.020,0.000).There was a significant increase in the postoperative miR-192 levelin patients with hilar interruption compared with those without hilar interruption(P=0.001).MiR-192 was positively correlated with ALT and AST(r=0.930,0.744, P=0.000,0.000).The dosage ofpropofolwas positively correlated with ALT,ASTand miR-192(r=0.231,0.248,0.232,P=0.020, 0.012,0.020).The duration of operation was positively correlated with ALT,AST and miR-192(r=0.184,0.241,0.185,P=0.011, 0.001,0.011). Conclusion This study shows that the expression of miR-192 in plasma has a good correlation with liver injury after liver tumor resection under general anesthesia with propofol.MiR-192 may be sensitive to ischemic liver injury and traumatic liver injury and may be used as a postoperative marker ofliver injury after liver tumor resection.