改良皮肤癣菌培养基的实验室研究

江情，李婕，金云，罗云鹏，陶丽，高仰敏，占萍

(江西省皮肤病专科医院江西省皮肤病研究所，江西南昌330000)

改良皮肤癣菌培养基的实验室研究

江情，李婕，金云，罗云鹏，陶丽，高仰敏，占萍

(江西省皮肤病专科医院江西省皮肤病研究所，江西南昌330000)

目的探讨改良DTM培养基对皮肤癣感染的诊断价值。方法采用三点接种法，将临床常见的8种皮肤癣菌、9种非皮肤癣菌和11份临床皮肤病皮屑标本接种于DTM培养基及2种改良DTM培养基上，28℃培养7d，每24h观察一次菌落生长及三种培养基颜色变化情况。结果皮肤癣菌中除紫色毛癣菌外均可使原DTM（橙黄→红色）和溴百里酚蓝改良DTM变色（土黄→深蓝），而紫色石蕊改良后DTM无颜色变化。其中须癣毛癣菌、许兰毛癣菌与絮状表皮癣菌在溴百里酚蓝改良DTM上培养3d变色明显，而在原DTM上需培养4d才会出现明显颜色变化；非皮肤癣菌致DTM变色均需培养5d以上。结论皮肤癣菌使溴百里酚蓝改良DTM变色跨度大，肉眼易判读；且比原DTM培养基更为敏感，有利于皮肤癣菌感染的快速诊断，值得大力推广应用。

皮肤癣菌培养基；溴百里酚蓝；快速诊断

皮肤癣菌试验培养基（dermatophyte test medium，DTM）于1969年由Taplin等发明，应用于头癣致病真菌的分离与鉴定，其原理是在沙煲弱培养基（Sabouraud＇s dextrose agar，SDA）基础上加入庆大霉素，金霉素与放线菌酮，抑制细菌及绝大多数腐生真菌的生长，从而选择性培养皮肤癣菌[1-3]。其中添加了酚红指示剂，皮肤癣菌生长中释放的碱性代谢物可使培养基pH升高，颜色由黄色变为红色，通常培养3～7d即可使培养基变色[1，4，5]。虽然仅根据培养基颜色变化，难以将皮肤癣菌精确鉴定到菌种，但对治疗药物的选择提供了充足的信息[2，6，7]。DTM具有简便、快速等优点，在癣病诊治中有着较好的应用前景[2，5，8]。在我国，由于DTM为进口试剂，较为昂贵，购买周期也较长，李筱芳等报道了一种改良DTM培养基用于快速鉴定甲癣，将原酚红改为溴百里酚蓝，使其培养基颜色变化在视觉上更加直接、更易判读，为皮肤癣菌感染的快速诊断及合理用药提供了便利[4]。我们以溴百里酚蓝和石蕊作为指示剂对DTM培养基进行了改良，比较分析了临床常见皮肤癣菌使3种培养基颜色变化情况，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂DTM培养基：葡萄糖，大豆蛋白，琼脂，放线菌酮，氯霉素，庆大霉素，金霉素，酚红指示剂，溴百里酚蓝，紫色石蕊指示剂。

1.2 实验样本实验菌株来自江西省皮肤病专科医院真菌科的临床标本菌株，经形态学和ITS区分子学鉴定到菌种，分别为絮状表皮癣菌、红色毛癣菌、犬小孢子菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、石膏样小孢子菌、断发毛癣菌、许兰毛癣菌、近平滑念珠菌、阿萨西毛孢子菌、尖孢支孢霉菌、球形孢子丝菌、伞枝横梗霉菌、球孢枝孢菌、裴氏着色真菌各1株，白念珠菌和烟曲霉各2株；另外7份皮屑标本来自真菌镜检阳性标本，分别来自手部（经培养鉴定为红色毛癣菌）、面部（断发毛癣菌）、头发（断发毛癣菌）、膝盖（须癣毛癣菌）、耳朵（红色毛癣菌）、小腿（红色毛癣菌）和腹股沟（红色毛癣菌），1份花斑糠疹阳性标本，4份真菌镜检阴性标本来自玫瑰糠疹、湿疹、神经性皮炎和银屑病患者。

1.3 质控菌株和实验质控本实验中采用了五株标准菌株作为质控菌株，分别为须癣毛癣菌CBS 347.55、红色毛癣菌CMCC(F)T1i，紫色毛癣菌CMCC(F)T3l、许兰毛癣菌CBS 139215。另外，对临床菌株，均提取DNA，扩增ITS区测序，明确菌种。临床菌株分子测序方法具体方法见以前的报道，将临床分离获得的菌株转种于弱沙煲葡萄糖蛋白胨培养基（SDA）培养基，生长良好后，刮取适量菌丝提取DNA[9]，用ITS1/ITS4引物对扩增ITS区[10]，测序结果于NCBI数据库上Blast，鉴定菌种，要求序列同源性≥99%且形态学符合的菌种。

1.4 配制原DTM培养基[1]葡萄糖1%，大豆蛋白1%，琼脂2%，酚红0.02%，放线菌酮0.4g/L，氯霉素0.1g/L，庆大霉素0.1g/L，金霉素0.1g/L，pH5.5± 0.1；所有试剂溶解于800ml蒸馏水中，搅拌溶解，定容至1000ml，微波炉加热至琼脂完全溶解后分装至试管中，于121℃高压灭菌20min，继而置于斜面冷却备用。

1.5 改良DTM培养基-溴百里酚蓝[4]葡萄糖1%，大豆蛋白1%，琼脂2%，溴百里酚蓝0.5%，放线菌酮0.4g/L，氯霉素0.1g/L，庆大霉素0.1g/L，金霉素0.1g/L，PH5.5±0.1；配制方法同上。

1.6 改良DTM培养基-石蕊葡萄糖1%，大豆蛋白1%，琼脂2%，紫色石蕊0.5%，放线菌酮0.4g/L，氯霉素0.1g/L，庆大霉素0.1g/L，金霉素0.1g/L，pH5.5±0.1；配制方法同上。

1.7 实验分组8种皮肤癣菌株和9种非皮肤癣菌株组为实验组，7种真菌镜检阳性皮屑标本为阳性对照组，5种非皮肤癣病临床标本为阴性对照组。采用三点法接种实验样本于新鲜配制培养基上，28℃培养7d，每24h观察一次菌落生长及三种培养基颜色变化情况。以上实验操作均重复三次。

2 结果

2.1 皮肤癣菌和非皮肤癣菌使三种培养基变色情况实验结果显示，在以石蕊为指示剂的培养基上，菌株生长正常，但培养基颜色未见明显改变，不能起到快速鉴定菌种的作用。原DTM和改良DTM-溴百里酚蓝培养基上，8株皮肤癣菌株均使变色。原DTM颜色由橙黄→淡红→红色，溴百里酚蓝改良后DTM颜色由土黄→青绿→深蓝。

培养72h，改良DTM-溴百里酚蓝上须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、许兰毛癣菌的质控株和临床来源的絮状表皮毛癣菌略有变色，变为浅青色；临床来源的须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌和许兰毛癣菌明显变色，为青绿色，见图1-a。使原DTM发生颜色改变的菌株相同，但变为淡红色。非皮肤癣菌均未使两种培养基变色，见图1-b。

培养第5d，13株皮肤癣菌使溴百里酚蓝改良DTM和原DTM培养基均变色，其中临床菌株变色最为明显的菌种为絮状表皮癣菌、须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌、断发毛癣菌和许兰毛癣菌，而红色毛癣菌和犬小孢子菌变色较浅。此外，阿萨西毛孢子菌和伞枝横梗霉菌的培养基开始发生肉眼可辨的颜色改变，见图1-c。

培养第7d，溴百里酚蓝改良DTM上，临床皮肤癣菌中除紫色毛癣菌外均使培养基变为深蓝色；原DTM上，除紫色毛癣菌外均使培养基变为红色；非皮肤癣菌中阿萨西毛孢子菌、尖孢支孢霉菌、枝顶孢霉菌、球形孢子丝菌、裴氏着色真菌、伞枝横梗霉、烟曲霉菌也使改良的DTM变色，白念珠菌、球形孢子丝菌、裴氏着色真菌、伞枝横梗霉菌和烟曲霉菌使原DTM培养基变色。见图1-d。

不同的菌种在不同皮肤癣菌培养基上的变色时间存在差异。须癣毛癣菌、许兰毛癣菌与絮状表皮癣菌在改良DTM上变色时间为3d，在原DTM上为4d；非皮肤癣菌致DTM变色均在培养5d以后。改良后的DTM变色由土黄变为深蓝色，原DTM变色由橙黄变为红色，由于橙黄色与红色之间跨度并不是很大，因此易造成误读或延迟判读，然而改良DTM变色跨度大，使判读更为为迅速和直观，有效的节省鉴定时间（表1）。

2.2 皮屑标本使两种DTM培养基变色情况将7种来自临床皮肤癣菌病且真菌镜检阳性的皮屑和5种非皮肤癣病临床标本接种于溴百里酚蓝改良DTM和原DTM培养基，培养7d，结果显示镜检阳性标本均使两种DTM变色，非皮肤癣病标本未能使两种DTM变色，其中手部和耳部皮屑标本使改良DTM完全变色（深蓝色），而原DTM并未完全变色，显现出淡红色，造成延迟判读和诊断困难，见图2。实验证明溴百里酚蓝改良后DTM对皮肤癣菌感染诊断灵敏度高于原DTM，为临床诊断缩短了时间。

表1 不同菌株使三种改良DTM变色情况

图1 皮肤癣菌与非皮肤癣菌使两种DTM变色情况

图2 临床标本使两种DTM变色情况情况，上排为改良DTM-溴百里酚蓝，下排为原DTM培养基。从左到右的标本分别来自手部、面部、头发、膝盖、耳朵、小腿，股部的癣病镜检阳性标本，第五为花斑糠疹皮屑，后4个为真菌检查阴性皮屑。

3 讨论

皮肤癣菌试验培养基（DTM）无需专业培训[1，4]，相比沙氏培养基鉴定法缩短1周时间，是一种相对简单、快速、有效的诊断方法[5，11，12]。更有专家学者认为皮肤癣菌在DTM上的分离率与鉴别率高于SDA培养基，是一种污染率更低的，优于SDA的培养方法[13-16]。美国关于甲真菌病的几项研究表明，DTM鉴定法还可用于诊断甲真菌病，具有简便、快速和准确的优点，比传统培养鉴定法效价比高，值得大力推广应用[2，8]。

本研究在原有DTM培养基的基础上，选择石蕊、酚红和溴百里酚蓝指示剂，摸索三种培养基对皮肤癣菌的变色情况。这三种指示剂为实验室常用酸碱指示剂，且变色点为外界环境由酸性变为碱性。皮肤癣菌在酸性培养基中生长，释放碱性酶类，导致培养基PH提高，可能会产生颜色改变。研究发现，改良DTM-石蕊培养基显现深紫色，将皮肤癣菌和非皮肤癣菌接种后一周，可见菌落生长，但是颜色变化不明显，难以区分皮肤癣菌和非皮肤癣菌。

而溴百里酚蓝和酚红指示剂组均观察到明显的颜色改变。实验研究表明，8种皮肤癣菌在培养一周时间内酚红组由橙黄色变为淡红，再到深红，溴百里酚蓝组由土黄色变为青绿色，再到深蓝色。但是，溴百里酚蓝组颜色变化更早，且直观敏感，更加直接易判读，有助于准确和迅速的诊断，大部分皮肤癣菌判断时间可缩短一天。

不同皮肤癣菌的变色程度存在差异，其中须癣毛癣菌、许兰毛癣菌和絮状表皮癣菌最早，三天内就可以在溴百里酚蓝组看到明显的颜色改变，此时酚红组尚无明显变化；培养7d皮肤癣菌均使两种DTM变色，其中红色毛癣菌和犬小毛癣菌变色时间较晚，另由于紫色毛癣菌生长缓慢，一般需2～3周方可见明显菌落，因而本实验中紫色毛癣菌未能使两种DTM培养基发生变色，推测不同的皮肤癣菌生长速率存在差异，产生碱性蛋白酶的速度也因之变化。这在一定程度上可以帮助大致判断癣病感染的菌种。

随着培养时间延长，培养基的特异性降低，如第7d，部分非皮肤癣菌培养基也发生类似的颜色改变，丝状菌最为显著。说明DTM培养基和改良培养基的特异性随着时间延长而下降。

来自临床的皮屑直接培养组显示，皮肤癣菌感染标本接种后，一周内可观察到颜色改变，且非皮肤癣菌标本未见变色。提示DTM和改良DTM培养基可以用于临床标本的直接检测。

研究结果表明，比较三种指示剂的皮肤癣菌培养基，石蕊无法起到鉴别皮肤癣菌的作用，而溴百里酚蓝比酚红更为敏感，判读更容易，有利于快速诊断。此种培养基配制简单，成本低廉，对设备和技术人员的要求较低，非常适用于缺乏专业真菌人才的医疗单位和广大的基层医疗单位，有较好的临床价值和良好应用前景，值得大力推广。

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Study on the modified dermatophyte test medium

JIANG Qing，LI Jie，JIN Yun，LUO Yunpeng，TAO Li，GAO Yangmin，ZHAN Ping.
Dermatology Hospital of Jiangxi Province，Institute of Dermatophyte of Jiangxi Province，Nanchang 330001，China.

Objective To study the traditional dermatophyte test medium(DTM)and its two modified(DTM)medium in identifying common dermatophytes.Methods Totally 8 dermatophytes species，9 non-dermatophytes fungi and 11 clinical samples were inoculated on DTM and the two modified DTM media，and all tests repeated three times.Results The medium color changed in both DTM(yellow to red)and DTM-BB(gray yellow to mazarine blue)with dermatophyte growth except Trichophyton violaceum，while no change occurred in DTM-L.The turning points of Trichophyton mentagrophytes，Trichophyton schoenleinii and Epidermophyton floccosum were 3 days in DTM-BB，4 days in DTM；However，the turning points of non-dermatophyte were longer than 5 days.The same results obtained when clinical samples were tried.Conclusion The DTM modified with bromothymol blue(DTMBB)was more specific and sensitive to identify dermatophytes species than the traditional DTM medium，and it could be applied in clinics as a dermatophyte test technique which is helpful for distinguishing dermatophytosis from non-dermatophytes infections.

∶Dermatophyte test medium；Bromothymol blue；Rapid diagnosis

R446.5，R379

A

1674-1129(2017)03-0318-04

2016-07-25；

2017-03-09)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.008

江西省卫生计生委科技计划项目：20177050

江情，女，1985年生，检验师，主要研究方向为皮肤癣菌。

占萍，女，1980年生，皮肤性病学博士，主要研究方向是皮肤癣菌。zhanping1980@163.com