梯型板和全自动加样仪在疑难配血中的应用

钟展华，孙爱农

(1、惠州市中心血站，广东惠州516000；2、中山市中心血站，广东中山528403)

梯型板和全自动加样仪在疑难配血中的应用

钟展华1，孙爱农2

(1、惠州市中心血站，广东惠州516000；2、中山市中心血站，广东中山528403)

目的建立一种应用于采供血机构的快速筛选除ABO血型以外特定红细胞抗原血源的方法。方法血站检验科在日常做ABO血型检测时，将稀释红细胞的生理盐水改为红细胞保养液，检测后将稀释板标示后保存，编写智能化全自动加样程序，利用全自动加样器将混合的血型抗体液和供者的红细胞加入Olympus梯形板，筛选出相同血型抗原阴性供者。结果梯形板联合全自动加样器的方法和传统的试管法均能全部筛选出相同血型抗原阴性供者，但梯形板联合全自动加样器法所需时间大大低于传统的试管法。结论梯形板和自动加样器的联合应用，为特殊患者筛选合适血源，具有快速、准确和低成本的效果，适合在采供血系统推广。

Olympus梯形板；血源筛选；全自动加样器；疑难配血

不规则抗体一般指ABO血型系统以外的其他血型系统抗体，主要经输血或妊娠等免疫产生，不规则抗体会导致输血反应；轻者引起寒战、发热，影响治疗效果；重者破坏输入的不配合的红细胞或缩短其寿命，产生溶血性输血反应，危及病人生命；根据相关的文献报道，最易产生血型不规则抗体的为Rh血型系统，MNS血型系和kidd血型系统[1，2]，对于有不规则抗体或者含温自身抗体且难于鉴定抗体类型的患者，上述血型系统表型相同的输血可以避免溶血性输血反应的发生，为此我们建立一种用Olympus梯型板和全自动加样器智能化技术联合应用的方法，可以为此类特殊的受血者从血站的血库中快速筛选出相合血液，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要硬件STAR全自动加样器，瑞士Hamilton公司生产，配套英文控制软件版本为4.30；恒温振荡器(上海微百科技公司)；CT6D平板离心机(日本日立公司)；DK-600S三用水浴箱(广东环凯科技公司)；KA-2200离心机(日本久保田公司)；anthos ht3酶标仪(奥地利anthos公司)；10～100μl、20～200μl可调量程微量移液器(美国热电公司)；120孔梯形微孔板，由日本奥林巴斯公司生产；96孔普通微量塑料平底板。

1.2 主要试剂单克隆IgM的抗-D、抗-E、抗-e、抗-C、抗-c试剂均由上海血液生物医药有限公司生产；单克隆IgM的抗M，N，S，s Jka，Jkb试剂由加拿大Dominion公司生产、血袋用的红细胞保养液由山东威高公司生产，生理盐水。以上试剂均在有效期内使用。

1.3 方法

1.3.1 本实验室的ABO血型检测的正定型和Rh血型的检测采用通用的微板法[3]，平时实验后稀释板中的红细胞未用完放2～6℃冰箱保存，稀释液为采血袋用的红细胞保养液，稀释板跟其他酶标板同时进行条码标记，并打印微板布局，以确定每个微孔的献血者编码。

1.3.2 使用STAR加样器上，参考文献[3，4]的方法和参数，编写的加样方法实现了和站内信息系统的双向通讯，使用上述的平底板稀释板，将浓度为5%的献血者红细胞加分别到5块梯形板上，每块120孔，一共600孔，每板设置一个阳性对照孔和一个阴性对照孔，加样程序能够自动判定稀释板的红细胞对应血液的血型、检测结果和库存状态，共使用稀释板20块，一共选取590例O型及化验合格者，常规ABO血型检测的日期为2015年12月1日到2015年12月8日，本次实验的时间为2015年12月20日。

1.3.3 将试剂抗-C和抗-e两种等量混合，编号No. 1；将试剂抗-C和抗-e和Jka三种试剂等量混合，编号No.2；将试剂抗-C和抗-e和Jkb三种试剂等量混合，编号为No.3；将试剂抗-C和抗-e和抗-M三种试剂等量混合，编号为No.4；将试剂抗-C和抗-e和抗-N三种试剂等量混合，编号为No.5。No. 1阴性的表示C、e均阴性，No.2阴性的表示C、e、Jka均阴性，No.3阴性的表示C、e、Jkb均阴性，No.4阴性的表示C、e、M均阴性，No.5阴性的表示C、e、N均阴性。

1.3.4 用STAR加样器将编号为No.1～No.5的5种试剂分别加入到已加献血者标本的5块梯形板上，每孔25μl。阴性孔加入RhD阴性献血者红细胞和抗-D，阳性孔加入RhD阳性献血者红细胞和IgM抗-D。

1.3.5 将已加试剂的梯形微板放置微量在振荡器上，设定振荡频率为35Hz和45Hz之间，振荡20s，使孔内红细胞和抗体试剂充分混匀，然后静置30min。有实心圆点的为阴性结果，均匀分布的为阳性结果，记录微孔位置，查找相应的献血者编码。

1.3.6 用手工试管法进行对照实验，献血者的标本采用的是血辫子，方法参考文献[5]，记录全过程所需时间。

2 结果

2.1 梯形型板法筛选590例献血者寻找相应抗原阴性与手工试管法效果对比结果见表1。

2.2 梯形型板法筛选过程记录见表2。

表2 梯形型板筛选过程记录

2．3灵敏度比较试验每种抗体试剂选取一个阳性标本，将每种抗体试剂稀释2～64倍，结果见表3。

2.4 使用红细胞保养液和生理盐水做稀释液检测效果对比只使用阴性对照孔和阳性对照孔用红细胞保养液做稀释的红细胞在悬浮红细胞过期报废之前均不影响结果，用生理盐水稀释的红细胞在第5d就已经轻度溶血，且无法分辨阴阳性对照了，结果见表4。

2.5 梯形型板法筛选实际使用结果记录从2016年3月份到2016年9月份，本站共收到临床送检的4例含温自身抗体的患者的疑难配血需求，因为患者血清中含自身抗体，常规方法无法为患者找到相合的血液，为防止自身抗体掩盖同种抗体，采用本研究的方法为患者筛选血液，输血后临床均未见明显输血反应，结果见表5。

3 讨论

含温自身抗体的标本，因红细胞被致敏，血浆中存在自身抗体，无论是血清学检测还是临床的配合性试验，都是很难处理的问题，常常困扰着输血工作者。患者血清中自身抗体特别是含有温自身抗体如果按照常规实验将很难获得相合的血液，因为自身抗体尤其是温自身抗体的存在会干扰同种抗体的检出；患者如果输入含同种抗体对应抗原阳性的血液，可使其产生溶血性输血反应，严重的可能产生致命的危险[6]。按照以往的做法是使用自身红细胞，先进行放散实验，放散掉黏附在自身红细胞上的抗体，然后再吸收自身血清中的抗体，反复进行多次，以此排除自身抗体的干扰[8]。然而在实际工作中，严重贫血的患者血样中的红细胞通常很少，做吸收放散实验很容易溶血，实验也非常繁琐耗时，而且很难奏效。Shirey RS等学者提出对有温自身抗体的或者难于鉴定同种抗体类型的患者，可作预防性供者抗原配型进行血液输注[7]。上海血液中心的向东等也提出使用Rh血型系统、MMS血型系统及Kidd血型系统抗原匹配的红细胞输注，就可基本上避免同种抗体引起的严重输血反应。以此省略复杂耗时的的自身吸收放散等操作，使患者得到及时有效的输血治疗[8]。对于有生育能力的女性患者的输血，笔者认为使用DCcEe抗原以及M、S、Jka、Jkb等抗原匹配的红细胞输注，就可基本上避免产生不规则抗体，从而最大限度防止因血型抗体导致的新生儿溶血病的发生。

表3 抗体试剂灵敏度检测结果

表4 红细胞保养液和生理盐水做稀释液检测效果对比

表5 梯形型板法筛选实际使用结果记录

在确定患者的Rh血型系统以及MMS血型系统及其他血型系统的抗原后，就需要筛选对应抗原同样也为阴性的血源，但如果遇到的是低频率血型抗原阴性的红细胞，医院输血科很难在库存血中筛选出出相合的血液。输血科此时只有请求血站协助筛选血液。血站筛选的方法一般使用试管法和微板法，试管法因为难于实现自动加样，不适合进行大批量的标本筛选。如果使用传统试管法进行大批量的血源筛选，需要耗费大量的时间来进行试验，可能会耽搁患者宝贵的抢救时机。国内的罗海玲等使用U型板为疑难配血的患者进行抗原筛选[10]，但是U型板法需要进行离心和震荡，不利于弱抗体的检出，因而U型板法要求抗体试剂的效价较高，本实验采用微板法中抗原抗体反应最为敏感的梯形板。梯型微板法原理是采用孔壁呈阶梯状的特殊V型微孔板，微孔内发生相应的抗原抗体反应（凝集）时，红细胞会彼此粘成凝块，挂在阶梯上，均匀分布于孔内底面阶梯上.未发生抗原抗体反应(非凝集)时，红细胞沿阶梯滚落于孔底中央形成实心圆点，观察微板的底部即可判定是否发生抗原抗体反应[11]。

本实验所使用方法的红细胞保养液取自成分分离红细胞时，有些血袋破袋或者采集不足量的时候，将有剩余的红细胞保养液，在一般情况下，将会丢弃，日常检测ABO正定型和Rh血型的稀释板也是做完实验就当医疗垃圾进行处理的，平时我们为患者配血的需要到血库拿血袋的辫子来进行，非常费时费力。使用本研究所使用的方法方便快捷，不需要动用献血者原始标本和血袋的辫子，直接选择保存在2～6℃冰箱含有献血者红细胞的稀释板，可以为此类危重患者争取宝贵的抢救时间。

受条件所限，本实验使用的抗体没有包括Duffy，Lewis等其他血型系统，因而并不能100%保证避开不规则抗体，有条件的血站可以加入其他血型系统的抗体，本组实际应用标本数也不多，需要用更长时间和更大批量的实验去进行验证。

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R457.1+1

A

1674-1129(2017)03-0451-04

2017-03-09；

2017-04-14)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.056