江西省呼吸道感染儿童人博卡病毒基因特征分析

李健雄，徐刚，施勇，龚甜，周珺，熊英

(江西省疾病预防控制中心，江西南昌330029)

江西省呼吸道感染儿童人博卡病毒基因特征分析

李健雄，徐刚，施勇，龚甜，周珺，熊英

(江西省疾病预防控制中心，江西南昌330029)

目的了解近几年江西省呼吸道感染儿童中人博卡病毒的基因特征和变异情况。方法挑取2011年8月至2015年12月采集的江西省呼吸道感染儿童的人博卡病毒阳性样本，利用RT-PCR对人博卡病毒全基因进行测序，利用DNAStar和Mega对序列进行拼接分析。结果共得到22株人博卡病毒全基因组序列，全都属于HBoV 1型病毒，且Ia簇，Ib簇，II组均有流行。毒株间以及与标准株ST2和ST1间的核酸同源性非常高，为97.6%～100%。蛋白质总共有12处氨基酸发生了变异。结论引起江西省儿童呼吸道感染的HBoV较为稳定，未发生明显的变异，但仍应该关注个别位点的变异是否会对病毒感染性及致病性产生影响。

人博卡病毒；呼吸道感染；儿童；基因特征

近年来，随着分子生物学技术在病毒学研究领域中的应用，由病毒引起的世界性呼吸道疾病越发显得突出。引起呼吸道感染的病毒变异快，种类多，迄今为止，仍有很多呼吸道感染的病因不明。人博卡病毒(Human bocavirus，HBoV)1-4型是最近几年相继被发现的一种病毒[1-4]，HBoV是目前已知的除B19病毒外唯一的对人类致病的细小病毒。当前，人博卡病毒已成为常见的导致小儿呼吸道感染的病毒之一，是一种不能忽视的呼吸道病毒，我省2011年至2015年呼吸道感染患儿的HBoV阳性率为5.7%[5]。本研究采集江西省2011年至2015年呼吸道感染儿童的标本，并对HBoV阳性标本的全基因进行测序，以进行江西省HBoV的基因特征分析及变异研究。

1 材料与方法

1.1 标本来源标本采集自江西省儿童医院呼吸内科，从2011年8月至2015年12月，采集不同发病时间的发热伴呼吸道感染症状的15岁以下的1508例儿童咽拭子或支气管灌洗液，共有86例患儿被检测出阳性。本研究根据采样时间及病毒浓度挑选阳性毒株进行测序。

1.2 主要仪器与试剂美国Bio-Rad PCR仪，法国VILBER LOURMAT凝胶成像系统、Qiagen DNA mini kit提取试剂盒，Promaga GoTaq Master Mix试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 病毒核酸提取标本震荡离心处理后，取200μl标本，采用提取病毒总核酸，提取方法参考试剂盒说明书。

1.3.2 博卡病毒PCR测序采用Promaga GoTaq Master Mix试剂盒进行RT-PCR反应对博卡病毒阳性标本进行PCR扩增，引物序列及反应条件参考文献[6]。

1.3.3 基因克隆及测序用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离回收阳性的博卡基因PCR扩增产物，回收的目的DN A片段连接到pGM-T质粒上，转化大肠杆菌DH 5A感受态细胞，筛选出的重组质粒，用PCR鉴定的阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测定。

1.3.4 序列分析从GenBank上下载标准毒株ST1 (DQ000495.1)，ST2(DQ000496.1)，CU74(EF203922.1)，WLL-1(DQ778300.1)，SH2(FJ375128.1)，CQ53(JX43 4059.1)，BJ3064(DQ988933.1)，HZ1403(KP710213.1)，FZ40(GQ455987)，HK24(EF450740.1)，ZJ92(JX8874 82.1)，GZ9081(JN794566.1)。采用DNAStar5.0、Mega7.0.21序列分析软件对人博卡病毒扩增的产物测序后核苷酸的进行拼接、核苷酸和氨基酸同源性以及遗传进化分析。

2 结果

2.1 HBoV检测结果本研究总共挑选30株阳性毒株进行测序，其中22株毒株测出完整序列，经过拼接比对，序列长度为5217bp，且均属于人博卡病毒I型。含四个编码序列，分别编码NS1（213～2132），NP1（2370～3029），VP1（3016～5031），VP2（3403～5031）四个蛋白。

2.2 同源性分析本次测的22株博卡病毒基因的同源性非常高，毒株间NS1，NP1，VP1，VP2四个基因的核苷酸同源性分别为99.3%～100%，98.8%～100%，98.1%～100%，97.7%～99.9%，蛋白同源性达到了99.8%～100%，99.5%～100%，99%～100%，98.9%～100%。与ST1毒株的核苷酸（蛋白）同源性分别为99.4%～99.8%（99.8%～100%），99.5%～100% (98.9%～99.8%)，98%～99.2%（99%～99.7%），97.6%～99.1%（98.9%～99.6%）。而与ST2毒株的核苷酸（蛋白）同源性更高，分别为99.6%～100%（99.8%～100%），99.2%～99.8%(99.5%～100%)，98.3%～100%（99%～100%），98%～99.9%（98.9%～100%）。

利用Mega软件对四个编码区分别进行进化分析，结果如图1。从图1（A）看出，对于核苷酸全基因，JX1938，JX1150，JX109，JX2184，JX1759，JX1 344，JX991和ST2的亲缘性较近，属于Ib簇。JX1 943，JX2200，JX1000，JX2239，JX1339，JX115和ST1的亲缘性较近，属于Ia簇，JX169和CU74的亲缘性较近，属于Ⅱ簇。而其他的毒株相对与三个标准株的亲缘性较远，且并不属于Ic簇，主要分为五个分支。对于四个基因，不同毒株的亲缘性差别较大，在不同基因上分属于不同的簇，具体见图1（B），图1（C），图1（D）。

图1 博卡病毒核苷酸序列进化树

2.3 氨基酸变异分析虽然不同毒株在各基因的核苷酸进化树分支不同，但核苷酸的有效变异较少，各蛋白间的差异非常小。同ST2株氨基酸相比较，NS1蛋白氨基酸只有JX109毒株在384位发生了D-＞N的变异。对于NP1蛋白氨基酸，JX1339，JX1943，JX2200，JX2239毒株在79位均发生了S-＞N的变异。而VP1/VP2蛋白氨基酸的变异相对较多，其中JX165变异最大，有L40S，T149N，G415S，N474S，F540Y，I560V和M613L共7处变异。其他毒株（除JX1344）在474位同ST1一样均有N-＞S的变异外，只有部分毒株发生了1处变异，包括D26N（JX1150），L40S（JX1000，JX2239），N546N（JX1293，JX2071），M631L（JX1597）。

3 讨论

人博卡病毒属于细小病毒科，细小病毒亚科，博卡病毒属，是除B19细小病毒外被发现的与人类疾病相关的细小病毒。病毒基因组为线性单链DNA，约5.2kb，含3个开放读码框，分别编码蛋白NS1、NP1、VP1和VP2，NS1能够启动病毒DNA的复制；VP1、VP2含有一个共同的重叠区，是病毒衣壳的重要结构蛋白。其衣壳蛋白VP1包含5’端的独有区（VP1-U）具有磷脂酶A2活性，与病毒的感染有关；NP1的功能尚不明确，可能与病毒基因的翻译过程有关[7]。

本研究选取的22株HBoV病毒经过测序比对发现，我省导致儿童呼吸道感染的HBoV均属于I型，总体上基因组较为保守，各基因间的同源性基本都在98%以上，相对较大变异区域位于VP1/VP2基因片段上，这和其他文献的报道是一致的[8～10]。根据基因进化树显示，HBoV可分为2个主要的组（Ⅰ组和Ⅱ组），其中I组又分为Ia，Ib和Ic3簇[11]。本研究对22株全基因的进化树分析发现，江西省流行的HBoV比较杂，除Ic3簇外，其余的Ia，Ib和Ⅱ组都有流行，而且还有10个毒株和国内流行的部分HBoV一样并不属于已知的所有组中。分析原因可能有两方面，一是江西省处于中部地区，和其他省份人员交流频繁，导致多种HBoV在我省流行。二是HBoV同源性较高，各组之间的亲缘性非常接近，各别基因的变异就容易导致新的组别产生。

通过对不同毒株蛋白的变异发现，NS1，NP1蛋白的变异非常小，和ST2株相比分别只有1株和4株毒株的1个位点发生了变异，但是NP1蛋白的变异位点位于N-糖基化位点，是否会对NP1蛋白的功能产生影响还未知。而VP1/VP2是病毒的衣壳蛋白，其中VP2占95%，VP1占5%[12]。根据已有的研究报道[13，14]，影响HBoV抗原性的主要区域有VP1的5’端独有的VP1U区、VP2的N端和βG-βH区域。其中VP1U区域磷脂酶A2（11～69位）的特异性活性基序（HDXXY，41～45位）是细小病毒科病毒侵入细胞的关键；VP2的N端区域(VP1的130～165位)富含甘氨酸，并且易于旋转；βG-βH区域（374～576位）氨基酸序列高度可变，其插入序列具有高度抗原性。本研究中除了474位和ST1株一样发生了变异外，其他的只有1株毒株在149位，415位，540位，460位的变异和2株毒株在546位的变异可能位于抗原性活性区域外，其余毒株均未在抗原活性区域有变异。而三株变异的毒株，特别是JX165毒株的变异是否会导致病毒的抗原性产生较大变化还有待进一步研究。

综上所述，本研究通过对江西省22株HBoV毒株的全基因测序，发现我省的HBoV同源性较高，但是少数抗原性的关键区域有个别氨基酸发生突变，可能与免疫逃逸有关。因此应加强对该病毒基因特性的监测，及时掌握其变异情况，这对该病毒引起疾病的预防和控制有重要作用。

[1]Allander T，Tammi MT，Eriksson M，et al.Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples[J]. PNAS，2005，102(36)：12891-12896.

[2]Arthur JL，Higgins GD，Davidson GP，et al.A novel bocavirus associated with acute gastroenteritis in Australian children[J].PLoS pathogens，2009，5(4)：e1000391.

[3]Kapoor A，Simmonds P，Slikas E，et al.Human bocaviruses are highly diverse，dispersed，recombination prone，and prevalent in enteric infections[J].J Infect Dis，2010，201(11)：1633-1643.

[4]Kapoor A，Slikas E，Simmonds P，et al.A newly identified bocavirus species in human stool[J].J Infect Dis，2009，199(2)：196-200.

[5]李健雄，张艳妮，施勇，等.江西省2011年-2015年呼吸道感染儿童人博卡病毒感染分析[J].实验与检验医学，2017，35(1)：20-22.

[6]Xu L，He X，Zhang DM，et al.Surveillance and Genome Analysis of Human Boca virus in Patients with Respiratory Infection in Guangzhou，China[J].PLOS One，2012，7(9)：1-9.

[7]KaPoor A，Slikas E，Simmonds P，et al.A newly identified bocavirus species in human stool[J].J Infect Dis，2009，199：196-200.

[8]李晓燕，陈锦英，孔梅，等.天津地区儿童人博卡病毒感染及基因型分析[J].中国公共卫生，2011，27(11)：1397-1399.

[9]杨晶艳，胡鹏威，陈蕊，等.四川地区儿童呼吸道感染人博卡病毒的流行特征与基因变异分析[J].四川大学学报(医学版).2014，45 (1)：57-61.

[10]Lindner J，Modrow S.Human bocavirus-a novel parvovirus to infect humans[J].Intervirology，2008，51：116-122.

[11]Lin JH，Chiu SC，Lin YC，et al.Clinical and genetic analysis of human bocavirus in children with lower respiratory tract infection in Taiwan[J].J Clin Virol，2009，44(3)：219-224.

[12]Rosenfeld SJ，Young NS，Alling D，et al.Subunit interaction in B19 parvovirus empty capsids[J].Arch Virol，1994，136(1-2)：9-18.

[13]漆正宇，瞿小旺，刘文培，等.人博卡病毒基因克隆及衣壳编码基因序列变异分析[J].病毒学报，2007，23(6)：447-453.

[14]修文琼，刘光华，康玉兰，等.人博卡病毒全基因组序列测定与种系分析[J].中国人兽共患病杂志，2010，26(2)：158-162.

Study of Genetic Diversity of Human Bocavirus in Children with Respiratory Tract Infection in Jiangxi

LI Jianxiong，XU Gang，SHI Yong，GONG Tian，ZHOU Jun，XIONG Ying.
Jiangxi Center for Disease Control and Prevention，Nanchang 330029，China.

Objective To identify molecular character and variability of human bocavirus(HBoV)in infants and young children with respiratory tract infection.Methods Respiratory specimens were taken from August 2011 to December 2015.The whole sequence of Human Bocavirus positive samples were sequenced to analyze the variation character by DNAStar and Mega.Results Totally 22 HBoV genes were successfully sequenced and phylogenetic analyses shows that were all belonged to type 1，and Ia cluster，Ib cluster，1b group II were all popular.Nucleic acid identity was 97.6%～100%.There were 12 the mutation amino acids in all strains.Conclusion HBoV cause d respiratory tract infection in children in jiangxi province was relatively stable，but still should pay attention to individual locus mutation that may lead to the change of virus infection and pathogenicity.

∶Human bocavirus；Respiratory infection；Children；Genetic traits

R511，R446.62

A

1674-1129(2017)03-0301-03

2016-12-28；

2017-05-18)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.003

江西省卫生计生委科技计划（20156015）

李健雄，男，1986年生，硕士研究生，主管技师，卫生检验，病毒学检验。