比色法测定比格犬尿液中柠檬酸的浓度

赵 宇，陈忠敏

(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)



比色法测定比格犬尿液中柠檬酸的浓度

赵 宇，陈忠敏*

(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)

建立了一种测定比格(Beagle)犬尿液中柠檬酸浓度的方法，利用柠檬酸与溴化钾、高锰酸钾在酸性溶液中生成五溴丙酮，五溴丙酮经石油醚(90℃～120℃)萃取后，与硫脲反应生成水溶性黄色复合物，其用紫外分光光度计在435 nm波长处测定。结果显示，柠檬酸浓度在0.005 mg/mL～0.25 mg/mL范围内，水溶性黄色复合物的吸光度与柠檬酸的浓度呈良好的线性关系，OD435=1.8335C+0.0038，r=0.9996，平均回收率为99.954%(n=5)，变异系数为1.64%(n=20)。该方法操作简单，快速准确，适用于非临床研究中Beagle犬尿液中柠檬酸浓度的测定。

比格犬；尿液；柠檬酸；比色法

柠檬酸化学名为2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸，是一种天然的果酸[1]，最初从柠檬中制取而得名。柠檬酸是机体内最重要的钙离子结合物，能降低尿中钙离子浓度，使钙盐饱和度下降，减少含钙类结石的形成[2]。柠檬酸是尿液中重要的抑制结石形成的物质，低柠檬酸尿是尿石症常见的生化异常指标之一，其发生率为19%～23%[3]。因此，检测尿液中柠檬酸浓度对尿石症的基础研究(包括尿石症动物模型的建立与评价)和临床治疗具有重要意义。早在1987年柠檬酸钾就被美国食品与药品管理局(FDA)批准作为单味药治疗远端肾小管酸中毒、低柠檬酸尿草酸钙结石以及尿酸结石伴有或不伴有含钙结石[4]。

近年来，对于Beagle犬尿液中柠檬酸浓度的测定方法少有报道。罗奇志[5]等通过在尿液中加入紫外吸收剂，利用高效毛细管电泳法来间接检测尿液中柠檬酸盐的含量，虽可达到一定的测定效果，但操作繁琐且试验中使用的毛细管易被堵塞。据报道有采用pH指示剂吸光度比值法[6]、高效液相色谱法[7]、超高效液相色谱法[8]、反相高效液相色潽法[9]和离子色谱法[10-11]测定柠檬酸的含量，但只适用于含单一成分的样品，而Beagle犬尿液中成分复杂，含有大量高浓度的干扰物质，采用这些方法直接检测比较困难。也有文献报道利用近红外光谱法[12]和离子色谱-质谱联用法[13]测定柠檬酸的含量，其灵敏度和准确性高，但所需试验设备非常昂贵。

本试验利用柠檬酸与溴化钾、高锰酸钾在酸性溶液中生成五溴丙酮，五溴丙酮经石油醚(90℃～120℃)萃取后，与硫脲反应生成水溶性黄色复合物。在一定范围内，水溶性黄色复合物的吸光度与柠檬酸的浓度具有良好的线性关系，据此可计算出Beagle犬尿液中柠檬酸的浓度。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用样品 Beagle犬尿液，来自湖北省食品药品安全评价中心的Beagle犬GLP实验室。

1.1.2 仪器设备 Easy 10型超纯水仪，力康生物医疗科技控股有限公司；SB-5200D型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；SC-3610型低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；Bio-DL可调微量移液器芬兰百得为澳洲宝德公司；UV-1800PC型紫外可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司；TP214型电子分析天平，丹佛仪器(北京)有限公司；JE1002电子天平，上海浦春计量仪器有限公司；VORTEX-5型漩涡混悬器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；79-1型磁力加热搅拌器，常州国华电器有限公司。1.1.3 药品与主要试剂 一水合柠檬酸、三氯乙酸、溴化钾、单质溴、30%过氧化氢溶液、硫脲、十水合四硼酸钠均为分析纯，全部为国药集团化学试剂有限公司产品；高锰酸钾，分析纯，洛阳昊华化学试剂有限公司产品，浓硫酸，分析纯，信阳市化学试剂总厂产品。

1 mol/L溴化钾饱和溴水溶液：在通风橱中，称取溴化钾59.50 g于烧杯中，加入适量UP水溶解后，再加入单质溴(液态)60.00 g，搅拌混匀后倒入500 mL棕色容量瓶中，并加入UP水至刻度线，配制成1 mol/L溴化钾饱和溴水溶液，避光保存待用。

316.5 mmol/L高锰酸钾溶液：称取25.00 g高锰酸钾晶体于烧杯中，加入适量UP水溶解后，倒入500 mL棕色容量瓶中，并加入UP水至刻度线，配制成316.5 mM/L高锰酸钾溶液，避光保存。

0.6 mol/L三氯乙酸溶液：称取24.51 g三氯乙酸晶体于烧杯中，加入适量UP水溶解后，倒入250 mL容量瓶中，并加入UP水至刻度线，配制成0.6 mol/L三氯乙酸溶液4℃保存。

0.1 mol/L十水合四硼酸钠水溶液： 称取38.14 g十水合四硼酸钠于烧杯中，加入适量UP水溶解后，放置于超声波清洗机中超声30 min～50 min后倒入1000 mL容量瓶中，并加入UP水至刻度线，配制成0.1 mol/L十水合四硼酸钠水溶液，室温保存。

0.53 mol/L硫脲十水合四硼酸钠水溶液：称取硫脲10.09 g于烧杯中，加入前面已配好的适量0.1 mol/L十水合四硼酸钠水溶液溶解后，倒入250 mL容量瓶中，并加入0.1 mol/L十水合四硼酸钠水溶液至刻度线，配制成0.53 mol/L硫脲十水合四硼酸钠水溶液，室温保存。

0.5 mol/L硫酸溶液：用移液管量取14.00 mL浓硫酸，用玻璃棒边搅拌边缓缓加到486 mL UP水中，混匀即成为0.5 mol/L硫酸溶液。

1 mg/mL柠檬酸标准溶液：经过换算，称取一水合柠檬酸0.2734 g于烧杯中，加入前面已配好的适量0.5 mol/L硫酸溶液溶解后，倒入250 mL容量瓶中，并加入0.5 mol/L硫酸溶液至刻度线，配成1 mg/mL柠檬酸标准溶液，保存在4℃环境中。

1.2 方法

1.2.1 试验操作步骤 取1 mL尿样，加入0.6 mol/L三氯乙酸溶液1 mL，混匀，静置10 min后以2500 r/min离心10 min，吸取1 mL上清液加0.5 mol/L硫酸溶液0.05 mL；在通风橱中加1 mol/L溴化钾饱和溴水溶液0.1 mL，混匀；10 min后加入316.5 mM/L高锰酸钾溶液0.25 mL，混匀；放置10 min后，边滴加30%过氧化氢溶液边摇动，使呈无色，消除多余的高锰酸钾，静置20 min；加石油醚(90℃～120℃)1.5 mL塞紧，充分振摇10min，离心5min；吸取上层醚液1 mL，加0.53 mol/L硫脲十水合四硼酸钠水溶液5 mL，塞紧，充分振摇5 min，以2500 r/min离心5 min；弃去上层醚液及混浊物，吸取下层水液进行比色，波长435 nm，光程1 cm；同时测定空白(0.5 mol/L硫酸溶液1 mL)。测定操作均采用1×15 mL离心管。

1.2.2 试验数据的处理 由柠檬酸标准溶液的直线方程为A=k·C+b，(A为吸光度，C为浓度)；可知Cx=N·(A﹣b)/k，(Cx为样品中柠檬酸的浓度，N为样品的稀释倍数，A为样品的吸光度)。

2 结果

2.1 最大吸收峰和最佳吸收波长的选择

配制0.005、0.02、0.05、0.1、0.2、0.25、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mg/mL的柠檬酸标准溶液，分别精密量取上述浓度的柠檬酸标准溶液1 mL，按试验操作方法开始操作，同时做空白对照(在分光光度上进行扫描时，空白试液作为校准背景)。取水溶性黄色复合物适量在UV-1800PC型紫外可见分光光度计上于波长350 nm～600 nm范围内扫描(如图1)，可知最大吸收波长λmax=435 nm ±1 nm。根据比色原理，该最大吸收波长即为测定时所要选择的最佳波长，故以435 nm作为测定波长。

2.2 标准曲线的绘制

精密量取1 mg/mL柠檬酸标准溶液0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.08、0.04、0.02、0.01 mL，分置15 mL塑料离心管中，分别加入0.5 mol/L硫酸溶液1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、1.92、1.96、1.98、1.99 mL，摇匀。按试验操作方法从加0.5 mol/L硫酸溶液0.05 mL开始操作，同时做空白对照(空白试液作为校准背景)，在435 nm处对每个浓度下的标准溶液所生成的水溶性黄色复合物的吸光度总共测3次，然后再取平均值，所得结果如表1和图2。

由图2可知，柠檬酸溶液浓度在0.005 mg/mL～0.25 mg/mL的范围内，吸光度与柠檬酸溶液的浓度呈良好的线性关系，其回归方程为OD435=1.8361C+0.0038，r=0.9996。

2.3 重复性试验

2.4 回收率试验

取10个15 mL塑料离心管，分为A和B两组，每组5个。对于同一份比格犬尿样，A组每个离心管中加入1 mL尿样，B组每个离心管中先加入1mL尿样，再依次分别加入1 mg/mL柠檬酸标准溶液0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mL，按实验操作方法测定两组中每个尿样中的柠檬酸的浓度(表2)。

图1 柠檬酸标准溶液生成的水溶性黄色复合物的吸收光谱

表1 柠檬酸标准溶液浓度与吸光度的关系

图2 柠檬酸标准溶液浓度与吸光度的线性关系

表2 回收率试验结果

*注：回收率=V·(CB-CA)/mB·100%；V为样品的体积，CB为B组柠檬酸浓度，CA为A组柠檬酸浓度，mB为样品中加入的柠檬酸的质量。

Note:Recovery rate=V·(CB-CA)/mB·100%；V.Sample’s volume; CB.The concentration of B’s citric acid; CA.The concentration of A’s citric acid; mB.The mass of citric acid which was put into the corresponding sample.

3 讨论

本试验中所用的比格犬尿液，来源于湖北省食品药品安全评价中心的Beagle犬GLP实验室。该实验室的温度和湿度可控，饲养环境良好，动物用饲料专间贮存，排除了黄曲霉毒素[14]等有毒有害物质对饲料的污染。试验人员用收尿瓶收集尿液时尽量轻拿轻放，减少对犬造成一定的应激反应[15]。总之，本试验尽可能地降低外部环境对犬生理生化指标的影响，所收集的尿液样品基本满足试验要求。

本法开始时加入0.6 mol/L三氯乙酸溶液，混匀后离心并吸取上清液，可以去除尿液中混有的少量蛋白质和某些无机成分，减少这些物质与溴化钾和高锰酸钾发生反应的可能性，提高测定结果的准确性。本法成败的关键在于30%的过氧化氢溶液完全消耗掉过量的高锰酸钾使反应体系呈无色，避免高锰酸钾本身的颜色对试验结果造成干扰。值得注意的是，当样品中的柠檬酸的浓度过低时，加入的30%的过氧化氢溶液的体积远远超过反应体系的总体积，此时用石油醚(90℃～120℃)1.5 mL来萃取生成的五溴丙酮已非常困难。那么空白试验中为什么加入很少量30%的过氧化氢溶液后，溶液很快会变成无色呢？这是因为空白试验中加入的样品是0.5 mol/L硫酸溶液1 mL，根据在酸性条件下，2KMnO4+5H2O2+2H2SO4=K2SO4+MnSO4+5O2↑+2H2O计算可知，此时硫酸对于高锰酸钾来说是过量的，故只需加入少量的30%的过氧化氢溶液即可。

《中国药典》2015版采用非水滴定法测定柠檬酸钾溶液的含量[16]，但只适用于单一成份或样品中杂质含量较少，较难运用于Beagle犬尿液中柠檬酸浓度的测量。本试验利用柠檬酸与溴化钾、高锰酸钾在酸性溶液中生成五溴丙酮，五溴丙酮经石油醚(90℃～120℃)萃取后，与硫脲反应生成水溶性黄色复合物，能进行比色测定的原理，建立了一种简单的采用紫外分光光度计测定Beagle犬尿液中柠檬酸浓度的方法，对于尿石症Beagle犬模型的建立与评价具有重要意义。

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Determination of Citric Acid in Urine of Beagle by Colorimetric Method

ZHAO Yu，CHEN Zhong-min
(CollegeofPharmacyandBioengineering,ChongqingUniversityofTechnology,Chongqing,400054,China)

The purpose of this study was to establish a method for measuring citric acid in urine of Beagle and evaluate application in non-clinical research.In this study,citric acid,bromatum kalium and potassium permanganate can act and generate pentabromoacetone in acid solution.The pentabromoacetone was extracted by petroleum ether and then reacted with thiourea to generate yellow compound of water solubility.And it can be measured by spectrophotometer in 435 nm wavelength.The final results in treated urine were determinated exactly.All the coefficients of variation were less than 5%.The recoveries for the five urine samples were all more than 95%.The methods is simple,accurate and fast.It is suitable for the determination of citric acid in the urine of Beagle.

Beagle ; urine; citric acid; colorimetric method

2016-09-25

赵 宇(1990-)，男，硕士研究生，主要从事基因工程药物研究。*通讯作者

S852.2

B

1007-5038(2017)06-0124-04