120dB白噪声对C57BL/6J小鼠听力损失的观察研究

王顶柳柯张悦杨仕明马秀岚

1中国医科大学附属盛京医院耳科

2首都医科大学附属北京友谊医院耳鼻咽喉头颈外科

3解放军总医院耳鼻喉头颈外科，解放军耳鼻咽喉研究所

·基础研究·

120dB白噪声对C57BL/6J小鼠听力损失的观察研究

王顶1柳柯2张悦3杨仕明3马秀岚1

1中国医科大学附属盛京医院耳科

2首都医科大学附属北京友谊医院耳鼻咽喉头颈外科

3解放军总医院耳鼻喉头颈外科，解放军耳鼻咽喉研究所

目的观察120dB宽频带白噪声对C57BL／6J小鼠听阈阈值、耳蜗基底膜毛细胞形态与带状突触数量的影响。方法：20只听力正常的5-6周龄C57BL／6J小鼠随机分为四组，3组实验组，分别为给予白噪声后立即测量组（0d）、噪声暴露后7天测量组（7d）、噪声暴露后14天组（14d）；1组对照组。每组5只小鼠（n＝10），实验组小鼠120dB白噪声暴露2h，0d组立即测量小鼠听阈，7天和14天应用相同方法测量小鼠听阈值，并计算出每只小鼠噪声暴露前后的阈移值。各组测量阈值后立即处死取耳蜗用4%多聚甲醛固定后进行免疫荧光染色和扫描电镜检查，观察小鼠带状突触与内外毛细胞形态变化并计数。结果噪声暴露2h后即刻组其各个频率5只小鼠（n＝10）阈值均未引出，暴露后七天小鼠听阈部分恢复（P<0.01）。暴露后第14天，14天组各频率的听阈继续恢复，但与暴露前的差异较第7天比有所减小，但仍有统计学差异（所有P<0.01）。并且观察到带状突触明显减少，扫描电镜观察外毛细胞纤毛有倒伏粘连。结论120dB白噪声噪声暴露2小时能够造成小鼠听力永久性阈移，外毛细胞明显损伤，带状突触数量明显减少。

永久性阈移；带状突触；噪声性耳聋；C57BL／6J小鼠；耳聋

现代社会中，噪声无处不在，人们也越来越重视噪声对于我们生活的影响[1]。近年来由于职业因素所造成的噪声性耳聋日益增多，在临床上所见病例也有所增加，据研究表明，每年由于各种原因导致听力下降者达到总人口的5.4%[3]，耳聋即听力下降已经成为困扰人们生活的主要病因之一，其中又以噪声性聋为首[4]。因外界噪声导致听力下降大体有两种形式，脉冲噪声和稳态噪声[5]，大多数研究者对于脉冲噪声研究较多，其在短时间内会造成听力损失，伴有强烈的耳鸣，因此在该环境中对于人们听力的保护尤为重要[6]。有实验表明，长时间处在嘈杂的环境中，尤其对于厂房等高强度的噪声环境下可以造成人短暂性听力损失，而且会使人们烦躁，记忆力减退，特别是在言语辨识度上有一定程度的下降，从长远的角度看，长时间位于高强度嘈杂环境下工作会对人体听力产生不可挽回的影响。本实验研究小组在之前的实验中将小鼠分别置于100dB、110dB白噪声环境下两小时，发现小鼠听力两小时后均有不同程度的损失，虽然在14天时均恢复到了暴露前阈值，不过ABR幅值均有不同程度的减小，并且观察到带状突触都有相应的减少。本实验利用120dB宽频带白噪声对于听阈正常的C57BL／6J小鼠进行时长2小时的暴露，观察小鼠听力变化及恢复程度，并且对于小鼠内外毛细胞形态及内毛细胞附近的带状突触的变化进行观察和研究。

1 材料与方法

1.1实验动物

本实验选择符合SPF级标准的雌性C57小鼠作为实验动物，年龄为5－6周龄，并筛选ABR正常小鼠入组，共计20只。饲养一周后，将小鼠随机分为3组实验组和1组对照组，每组5只小鼠。实验组分别为：P0(噪声暴露后0天)P7(噪声暴露后7天)以及P14(噪声暴露后14天)。本实验期间所有操作均得到解放军总医院伦理委员会的许可(实验动物均由中国军事医学科学院动物中心提供)。

1.2噪声暴露

采用120dB SPL的宽频带白噪声对试验组C57BL／6J小鼠进行噪声暴露2小时。暴露期间,将一组小鼠（5只，n＝10）置于鼠笼中，扬声器在鼠笼之上。为确保鼠笼之内声音强度在1dB之内，实验前我们应用标准声级计对声音进行校准，测量声音在鼠笼中的强度是否符合标准。

1.3 ABR检测

本实验室应用美国TDT公司的测听模块设备，biosig软件系统。小鼠测听前使用5%戊巴比妥钠(0.3m l~0.5ml/kg,腹腔注射)对小鼠进行麻醉后插入电极，直到检测不出波形，再增加5dB，测出可重复的波形，标记为听阈值[10]。

1.4耳蜗基底膜取材

各组电测听结束后处死小鼠，眼科剪断头，去除脑组织，分离颞骨与耳蜗,去除蜗壳，迅速将耳蜗放入4%多聚甲醛的培养皿中。应用显微镊在光学显微镜下戳破蜗顶，前庭窗和圆窗，灌流冲洗出淋巴液，4°C冰箱过夜。第二天标本取出用10% EDTA溶液脱钙2到3天，24小时换液一次。脱钙完成后置于PBS培养皿中，从底部到顶部缓慢剥去残留软化的蜗壳，前庭膜，盖膜，之后分离蜗轴与基底膜。按顶中底回分为三段。

1.5免疫组化

应用配置好的Triton100-X打孔30分钟，含有PBS缓冲液的5%的山羊血清封闭1小时，漂洗充分后加入一抗后孵育8h漂洗加入加入二抗（驴抗羊488抗体1:500和驴抗兔543抗体1:500），室温避光孵育1h，漂洗，甘油封片避光保存。

1.6共聚焦显微镜

选择488nm、543nm以及358nm波长的激发光，荧光激发下分别显示绿色、红色和蓝色。应用Zeiss正置共聚焦显微镜，对标本进行层扫，以信号出现开始到结束，收集图层以序号排列，叠加末置后形成最终的结果图片。

1.7统计学方法

采用SPSS21.0 IBM统计分析软件，以每只小鼠噪声暴露前后听阈值的差值作为独立样本，抵消个体差异和测量误差。对7天组和14天组应用配对样本t检验，One-way ANOVA,带状突触计数结果应用t检验，P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ABR结果噪声暴露结束后0d组5只小鼠click及各频段纯音听阈阈值未引出。7d时听阈有所恢复，click平均阈移值在80dB，暴露后14天时听阈阈移值停留在70dB。各频段纯音听阈阈值均有明显提高。对暴露后7天及14天各频率的听阈变化进行One-way ANOVA分析，在7天、14天，32kHz处阈移最小，且明显低于Click、4kHz、8kHz和16kHz处的阈移，差异有统计学意义（P<0.01，0.05），表明高频段受噪声影响较小。（见表1）

2.2扫描电镜结果根据扫描电镜结果分析，0d组中回部分即有部分外毛细胞的纤毛倒伏和粘连，7天和14天依然有外毛细胞的缺失，有两种情况，可能是凋亡，也有可能是缺失，这些都与听力阈值的全面提高有着必然的联系。噪声暴露后内毛细胞电镜中观察无明显变化。（见图1）

图1 可见噪声暴露后毛细胞纤毛严重缺失和脱落，内毛细胞未见明显缺失，细胞纤毛完整。箭头所指是外毛细胞纤毛缺失脱落的位置。可见噪声暴露后14天时外毛细胞纤毛倒伏融合。Fig.1 It’s seriously damaged and got loss about ciliums of OHC after noise exposure,but the damage of IHC isnotobvious.No deficiency is found in stereocilia of cell.The location of the arrow is the place where the OHC fall off.Cilia of OHC is lodged and fused in 14 daysafternoiseexposure.

2.3免疫组化结果Ctbp2和GluR2/3染色后可明显观察到Ctbp2标记的带状突触和GluR2/3标记的突触后递质在实验前后的变化，并将得到的组图结果进行叠加后进行了三维重建，并定量计数顶中底回内毛细胞附近的带状突触数量的变化（见图2），其得到的结果与听力的结果相一致，0天最少，7天和14天有所恢复，但与对照组相比均有较大的差距。(**P<0.01)（见图3）

图2 分别展示了对照组、即刻组、第七天组、第十四天组绿色的突触前递质，红色的突触后递质，以及橙色的完整突触的数量关系，可见噪声暴露后突触的数量有逐渐恢复的趋势，说明了突触的可塑性和自我修复性。Fig.2 green stands for presynaptic transm itter,red stands for postsynaptic transmitterand orange stands for themerged synaptic.We select three time points and record the number of RS respectively.The result shows that the number of synaptic has a tendency to recover gradually after noise exposure, what illustratesplasticity of the RS.

图3 可见突触前与突触后之间数量上无明显差异（P> 0.05），噪声暴露后即刻组突触数量明显下降，七天和十四天突触数量呈逐渐增多的趋势。与对照组比较即刻组，7天组和十四天组具有统计学意义（**P<0.01,*P<0.05）Fig.3 the result shows that the number of presynaptic and postsynaptic is no difference(P>0.05),the number of stat. group was obviously down,7days and 14days groups are increasing gradually.It has statistical significance comparing stat.group,7days group,14days group w ith the control group (**P<0.01,*P<0.05)

表1 120dB白噪声2h后各实验组阈移值结果Table 1 Resultsof the threshold shiftafter120 dBwhite noise for2 hours in each group

3 讨论

噪声性耳聋如今越来越受到研究者的关注，其早期表现为听觉疲劳，在脱离噪声环境后可以逐渐缓解，长时间暴露则难以恢复，最终导致感音神经性耳聋。在本实验中小鼠听力于噪声暴露后14天停留在70dB左右，本研究小组根据liberman实验室小鼠造模方法，在100dB、110dB中得到了相似的结果[7]，即14天小鼠听力完全恢复，不过在本实验中120dB暴露2h后C57BL／6J小鼠听阈显著提高，于14d时听阈停留70dB左右，在实验结果中中低频听力下降较重而高频听力下降相对较轻，这于liber⁃man的实验结果有所不同，其高频听力下降明显，有研究表明，不同种系的小鼠对于不同频段的纯音敏感性不同，即相同频段其ABR幅值亦不相同[8-10]。

根据此前研究小组结果，可以初步判断在2小时时长的噪声暴露中，120dB白噪声即可导致外毛细胞纤毛受损，形成永久性阈移[11]。小鼠顶回毛细胞纤毛形态细长可能容易形成缺损，底回外毛细胞纤毛形态短粗不易脱落粘连，纤毛形态上的差异可能导致缺损严重程度的不同；有研究表明，不同种系动物对于声音频率的敏感程度不同，因此对于宽频谱的白噪声而言，噪声暴露后造成各频率阈移值明显不同。这也印证了本实验听力学检测的结果。

除此之外，噪声暴露后所测量的ABR幅值极其混乱，未见正常的波峰波谷，无法测量其阈值，在liberman实验结果中有提到强噪声对中枢神经的影响，而且这种损伤存在其不可逆性[12-14]。我们对噪声暴露前和暴露后各时间点的小鼠进行耳蜗取材后对其螺旋神经节与传入神经之间的带状突触进行Ctbp2和GluR2/3标记，免疫荧光结果显示噪声暴露后带状突触信号计数明显下降，7天最低，在14天时有所恢复。这说明带状突触具有自我修复性和自我保护机制[15-17]。

本研究中，在实验研究小组的基础上对C57BL／6J小鼠采用120dBSPL的宽频带白噪声暴露2小时，建立了一种C57BL／6J小鼠的永久性阈移模型，并且对该模型的听力变化特点进行了研究。为今后对小鼠带状突触的研究和内外毛细胞的形态变化奠定了实验基础。该实验还有一些不足之处，如未设置更长时程的实验组，也没有对小鼠耳蜗外毛细胞缺失进行凋亡染色，以确定小鼠噪声暴露后是否启动了外毛细胞凋亡的机制，因此在实验结果上还有许多可以改进补充的地方。在今后的研究中，外毛细胞凋亡机制及带状突触的可塑性将会是本实验的重点研究方向。

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Effectsof high levelwhitenoiseexposure on hearing function in C57BL/6JM ice

Wang Ding1,Liu Ke2,Zhang Yue3,Yang Shiming3,Ma Xiulan1
1DepartmentofOtology,Shengjing HospitalofChina MedicalUniversity,Shenyang 110004,China
2DepartmentofOtolaryngology Head and Neck Surgery,Beijing Friendship HospitalofCapitalMedicalUniversity
3DepartmentofOtolaryngology Head and Neck surgery,InstituteofOtolaryngology,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing 100853,China

MAXiulan Email:maxl1@sj-hospital.org

Objective To investigate changesof hearing threshold,morphology and the ribbon synapses in the cochlear basilarmembrane after 2 hours exposure to white noise at 120 dB SPL in C57BL/6Jm ice.Methods Twenty C57BL/6Jmicew ith normalauditory thresholdswere random ly divided into four groups(n=5,10 ears,in each group). Animals in three groups(experiment groups)were exam ined at 0 day,7 days and 14 days after noise exposure.One group was used as control.Immunofluorescent staining and scanning electronm icroscopy(SEM)exam ination focusing onmorphology of OHCs and ribbon synapseswere conducted after auditory brainstem response(ABR)testing.Result Auditory thresholds could notbe detected at0 day after noise exposure.Compared w ith the control,ABR thresholds remained elevated at7 day afternoise exposure(P<0.01).ABR thresholds at14 days afternoise exposurewere better than at7 days after,although stillworse than the control(P<0.01).There was an obvious decrease in the number of ribbon synapsis.Adhesion and disarray of OHC stereociliawere seen on SEM.Conclusions Exposure to white noise at120 dB SPL for2 hours can lead to permanent threshold shift(PTS)inmice,causing severe damage to OHC and decreaseof ribbon synapses.

PTS；Ribbon synapses；NIHL；C57BL/6Jmice；Hearing loss

R764

A

1672-2922（2017）02-217-5

2017-01-10审核人：于宁）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.02.015

王顶，硕士研究生,研究方向:噪声性耳聋

马秀岚,Email:maxl1@sj-hospital.org