盐酸曲美他嗪对大鼠肾脏急性缺血-再灌注损伤及氧化应激反应的影响

杜艺 钱白音 李素霞 李宓

·实验研究·

盐酸曲美他嗪对大鼠肾脏急性缺血-再灌注损伤及氧化应激反应的影响

杜艺 钱白音 李素霞 李宓

目的 观察盐酸曲美他嗪(trimetazidine，TMZ)预处理对大鼠肾组织急性缺血再灌注损伤及氧化应激反应的影响。方法 选择SD大鼠90只，随机均分为A、B两组。A组给予TMZ，剂量10 mg/kg，灌胃5 d后建立缺血再灌注(ischemia-reperfusion injury，IR1)、缺血再灌注后处理(ischemic postconditioning，IPO1)、假手术(sham operated，S1) 模型；B组生理盐水灌胃5 d后建立缺血再灌注(IR2)、 缺血再灌注后处理(IPO2)、 假手术(S2)模型。检测各组末次恢复肾脏血供0、6、12、24、48 h后血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 水平。结果 与IR1组相比，IR2组6 h 的VCAM-1、MDA及24 h、48 h时BUN、SCr、VCAM-1、MDA、肾小管损伤程度评分明显较IR1组上升，SOD下降；IPO2组与IPO1组相比，6 h、12 h、24 h时VCAM-1、MDA均明显升高，SOD下降；24 h BUN、SCr、肾小管损伤程度评分也明显上升；IR1组与IPO1组相比，在24 h时除SCr外，BUN、VCAM-1、MDA、肾小管损伤程度评分均上升，SOD下降，48 h时VCAM-1、肾小管损伤程度评分明显较IPO1组上升，SOD下降；IPO2组与IR1组相比，在12 h、24 h时，VCAM-1、MDA、肾小管损伤程度评分均上升，SOD下降；在48 h时除MDA外，BUN、SCr、VCAM-1、肾小管损伤程度评分明显上升，SOD下降(P均>0.05)。结论 在大鼠肾脏缺血再灌注损伤发生之前即预防性使用TMZ可减轻氧化应激反应，使血清VCAM-1水平下降，与单纯缺血再灌注后处理(IPO)比较，氧化应激反应明显减轻，VCAM-1水平降低。

盐酸曲美他嗪；缺血再灌注损伤；氧化应激；黏附分子

缺血再灌注损伤是导致急性肾损伤的关键因素之一。大量研究表明，肾脏在缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IR)期间可通过氧自由基生成增加[1-2]、细胞内钙超载、多种凋亡调控基因的表达改变和黏附分子表达增加等途径诱导细胞凋亡，其中内皮细胞损伤、黏附分子表达增加、氧化-抗氧化平衡系统紊乱可能是IR导致急性肾小管上皮细胞坏死的重要因素之一[3]。因此，需要不断的寻找可以减轻肾脏氧化应激反应、降低黏附分子表达的药物，以改善急性肾损伤的预后。曲美他嗪是一种新型的心肌代谢类药物，可以通过其抑制脂肪酸β氧化，促进葡萄糖有氧氧化，从而起到抗心肌缺血，改善心功能的作用。目前，国内外的研究认为，它可能通过抗氧化应激的机制对心脏产生一定的保护作用[4-6]，本研究即观察盐酸曲美他嗪(trimetazidine，TMZ)在肾脏IR时对其氧化应激状态及血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)的影响。

材料与方法

一、实验材料

健康雄性SD大鼠90只(中山大学实验动物中心)15周龄，体质量(263±10)g；TMZ(法国施维雅药厂)；血清尿素氮(BUN)、 血肌酐(SCr)、VCAM-1、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；721分光光度计(上海精密科学仪器公司)；光学显微镜(日本olymus公司)。

二、动物模型制作与分组

随机将大鼠分为A、B两组，每组45只，适应性喂养2 d，温度约为23 ℃，湿度60%，12 h交替照明，自由饮水、饮食。第3天，A组给予生理盐水稀释的TMZ 10 mg·kg-1·d-1灌胃5 d，再随机分为缺血再灌注(IR1)组、缺血再灌注后处理组(ischemic postconditioning，IPO1)、假手术(S1)组，每组15只。B组大鼠生理盐水灌胃，生理盐水用法、用量同TMZ，再随机分为缺血再灌注(IR2)组、缺血再灌注后处理(IPO2)组、假手术(S2)组，每组15只。参考Basile等[7]的方法制备缺血再灌注的急性肾损伤动物模型， 缺血再灌注后处理(IPO)：在缺血45 min后用血管夹同时给予双侧肾脏恢复血供20 s、阻断血供20 s处理，反复10次后恢复血供。假手术组：手术方法同上，但仅分离出大鼠双侧肾动脉，不进行夹闭。手术后肉眼观察肾脏恢复灌注，除在0 h时取标本组没有缝合腹腔，剩余大鼠均逐层缝合腹腔。各组缺血过程保持大鼠肛温在36.5～37.0 ℃。

三、血清BUN、SCr、VCAM-I、MDA、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平检测

在末次恢复肾脏血供0、6、12、24、48 h，取A、B组缺血再灌注、缺血再灌注后处理大鼠各3只分别经眶后静脉丛采集静脉血2～3 ml，离心(3 000 r/min)15 min，取血清于-20 ℃保存，待测血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)。2组各时间点采血样本均为3只。化学比色法检测血BUN、SCr。应用酶联免疫吸附检测法(ELISA)测定VCAM-I、MDA、SOD。

四、肾脏组织形态学观察

脊椎脱臼法处死大鼠、开腹，取部分肾组织用100 ml/L甲醛固定，常规脱水、包埋、切片后行HE和PAS染色。光镜下观察形态，参考Paller等的方法进行评分，随机选择10个无重叠视野(×200)，每个视野下随机选择10处肾小管，共按100个肾小管计分，分数越高表示肾小管损伤程度越严重。

五、统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差表示，采用完全随机设计的单因素方差分析(ANOVA)，2组比较采用独立样本t检验，多组之间的两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

与IR1组比较，IR2组6 h的VCAM-1、MDA及24 h、48 h时BUN、SCr、VCAM-1、MDA、肾小管损伤程度评分明显较IR1组上升，SOD下降。与IPO1组比较，IPO2组6 h、12 h、24 h时VCAM-1、MDA均明显升高，SOD下降；24 h的BUN、SCr、肾小管损伤程度评分也明显上升。IR1组与IPO1组比较，在24 h时除SCr外，BUN、VCAM-1、MDA、肾小管损伤程度评分均上升，SOD下降，48 h时VCAM-1、肾小管损伤程度评分明显较IPO1组上升，SOD下降。IPO2组与IR1组比较，在12 h、24 h时，VCAM-1、MDA、肾小管损伤程度评分均上升，SOD下降；在48 h时除MDA外，BUN、SCr、VCAM-1肾小管损伤程度评分明显上升，SOD下降(P均>0.05)。(表1)

讨 论

IR的概念于1960年首次提出,指缺血组织或器官重获血流灌注或氧供应后,对组织或者器官所产生的损伤作用。肾脏IR是急性肾衰竭的常见原因, 也是肾脏移植术后影响移植物早期功能恢复和移植物长期存活的主要因素之一。本研究显示，SD大鼠无论在IR或IPO时均发生了急性肾损伤，A、B两组SD大鼠在24 h及48 h后均出现了血BUN、SCr及肾小管损伤程度评分的上升，与相应对照组比较有显著性差异，且出现了早期的MDA及SOD的下降，说明在IR或IPO时均存在氧化应激反应。在正常的肾脏，VCAM-1仅表达于鲍曼氏囊的壁层上皮细胞和少数的近曲小管上皮细胞，而内皮细胞不表达VCAM-1。本实验中A、B两组SD大鼠的血清VCAM-1水平均在6 h时与相应对照组比较显著上升，说明在IR或IPO时早期均已出现小管上皮细胞损伤，且VCAM-1主要参与免疫细胞的黏附与迁移，在免疫炎症反应中具有重要的作用，可能IR或IPO的早期即有免疫炎症反应的发生。

TMZ在心肌的保护作用中主要通过增强组织葡萄糖氧化代谢、恢复糖酵解和碳水化合物之间的耦联，在耗氧较少的情况下产生三磷酸腺苷，同时减轻心肌细胞内酸中毒和高钙血症、限制炎症反应以及减少氧自由基生成等抗缺血再灌注损伤从而起到保护心肌的作用[8-11]。本研究显示，IR2组与IR1组比较，6 h、24 h、48 h时IR2组的VCAM-1、MDA及24 h、48 h时BUN、SCr、肾小管损伤程度评分明显较IR1组上升，SOD下降；IPO2组与IPO1组比较，6 h、12 h、24 h时VCAM-1、MDA均明显升高，SOD下降，24 h时BUN、SCr、肾小管损伤程度评分均明显上升，SOD下降，说明经过TMZ预处理的SD大鼠无论在IR或IPO时均可以缓解急性肾损伤的程度，减轻肾小管损伤及氧化应激反应，使血清VCAM-1水平下降。

表1 各组BUN、SCr、VCAM-1、MDA、SOD水平及肾小管损伤程度评分的比较

注：与相应的S1组、S2组比较,aP<0.05；与IR2组比较,bP<0.05；与IPO2组比较,cP<0.05；与IPO1组比较,dP<0.05；与IPO2组比较,eP<0.05

急性肾缺血再灌注损伤后处理对缺血再灌注损伤的保护作用已经得到公认，IPO现已经是临床中对缺血-再灌注损伤治疗的一个重要手段，如在冠心病的治疗、器官移植中的运用[12-15]，其保护机制可能与抑制氧自由基堆积、增强机体的抗氧化能力、抑制细胞内钙超载及细胞凋亡等有关。近年来对急性肾损伤的药物的研究进展将其分为抑制细胞死亡类、抗炎类和修复类等，但在美国肾脏替代治疗仍是唯一被联邦食品药品管理局认可的治疗急性肾损伤的有效措施，尚没有药品得到认可，因此本实验同时与急性肾缺血再灌注损伤后处理对肾脏的保护作用做对比，进一步观察曲美他嗪的保护作用。本实验中IR1组与IPO1组相比，在24 h时除SCr外，BUN、VCAM-1、MDA、肾小管损伤程度评分均上升，SOD下降亦证实IPO的保护作用，同时IPO2组与IR1组相比，在12 h、24 h时，VCAM-1、MDA、肾小管损伤程度评分均上升，SOD下降；在48 h时BUN、SCr亦明显上升(P均>0.05)，提示实验前使用TMZ可获得与缺血后处理相似的收益。

综上所述，在IR发生前即预防性使用TMZ可以减轻肾脏IR的氧化应激反应，使VCAM-1水平下降。

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The influence of trimetazidine hydrochloride on acute ischemia-reperfusion injury of endothelial cells and oxidative stress response of rat kidney

DUYi,QIANBai-yin,LISu-xia,LIMi.

TheFifthAffiliatedHospitalofSunYat-SenUniversityRenalMedicineBloodpurificationCenter,Zhuhai519000,China

Objective To observe the effects of trimetazidine (TMZ) preconditioning on endothelial cell injury and oxidative stress in rats with acute renal ischemia-reperfusion. Methods 90 SD rats were randomly divided into A and B groups. Group A was given TMZ at a dose of 10 mg/kg. After lavaged for 5 days, ischemia-reperfusion injury (IR1), ischemic postconditioning (IPO1), sham operated (S1) were established. In the same way, the IR2, IPO2 and S2 were established in group B after 5 days of saline enema. The levels of serum creatinine (SCr), urea nitrogen (BUN), vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1), malondialdehyde (MDA) superoxide dismutase (SOD) were measured at 0, 6, 12, 24 and 48 h after the last recovery of kidney blood supply in each group. Results Compared with IR1 group, the levels of VCAM-1, MDA at 6 h and BUN, SCr, VCAM-1, MDA and renal tubular injury score at 24 and 48 h in IR2 group were significantly higher than those in IR1 group, while SOD was decreased; Compared with IPO1 group, the levels of VCAM-1 and MDA at 6, 12 and 24 h and BUN, SCr and renal tubular injury score at 24 h in IPO2 group were significantly increased, while SOD was decreased at 6, 12 and 24 h; Compared with IPO1 , apart from SCr, the levels of BUN, VCAM-1, MDA and renal tubular injury score at 24 h in IR1 group were increased and the levels of VCAM-1, renal tubular injury score at 48 h in IR1 group were significantly increased, and SOD was decreased at both time points; Compared with IR1 group, the levels of VCAM-1, MDA and renal tubular injury score at 12 and 24 h in IPO2 group were increased, while SOD were decreased and apart from MDA, the levels of BUN, SCr, VCAM-1 and renal tubular injury score at 48 h in IPO2 group were significantly increased, while SOD was decreased (P>0.05). Conclusions Compared with IPO alone, using TMZ can reduce the oxidative stress response and decrease the serum VCAM-1 level before the occurrence of IR in rats.

Trimetazidine hydrochlorid; Ischemia-reperfusion injury; Oxidative stress response; Vascularcelladhe-sionmoleculel

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.05.009

广东省医学科学技术研究基金(No.WSTJJ20101210640102196912170323)

519000 珠海，中山大学附属第五医院肾内科血液净化中心

2016-10-23

2017-02-02)