香菇多糖中半乳糖醛酸的含量测定及抗氧化活性研究

赵鹤鹏，许秋达，常 丹,周鸿立

（吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022）

香菇多糖中半乳糖醛酸的含量测定及抗氧化活性研究

赵鹤鹏，许秋达，常 丹,周鸿立*

（吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022）

研究香菇多糖中半乳糖醛酸的含量测定和抗氧化作用。采用硫酸-咔唑比色法与间羟基联苯法测定半乳糖醛酸的含量，采用羟基自由基、总还原力、1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基、超氧阴离子自由基、2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）自由基的清除作用考察5种不同体系香菇多糖的抗氧化活性。标准半乳糖醛酸质量浓度在26.15～78.45 μg/mL之间呈良好的线性关系，r=0.999 4，平均加样回收率为99.87%，RSD为0.11%，最低检出限为4.086 μg/mL，糖醛酸含量为30.25 μg/mg；香菇多糖质量浓度在0.2～1.0 mg/mL范围内抗氧化作用大小依次为羟基自由基、总还原力、DPPH，超氧阴离子和ABTS没在IC50范围内。硫酸-咔唑比色法简便易行、准确性高、重现性好，且多糖5种体系验证香菇多糖具有一定的抗氧化能力。

香菇多糖；糖醛酸；咔唑-硫酸比色法；抗氧化作用

网络出版时间：2017-4-20 14:09:52

0 引言

香菇（Lentinula edodes）[1]是全球第二大人工种植的食用菌，也是我国特产之一，在民间素有“山珍”之称，野生香菇主要生长在林区，种植生长在木材上。香菇味甘、性平。主治食欲减退，少气乏力。香菇多糖（Lentinan）具有抗肿瘤、抗病毒、提高免疫和刺激干扰素形成等功能[2]，已成为当前研究的热点。Mariko等[3]用 3%三氯乙酸和 1 mol/L NaOH溶液从香菇子实体中分别提取出一种杂半乳糖和α-(1→3)-D-葡聚糖，邹林武等[4]采用超声法提取香菇多糖，多糖得率7.24%且有较好的抗氧化活性。多糖常以酸性杂多糖糖醛酸的形式存在，糖醛酸本身或含有糖醛酸结构单元的低聚糖或多糖，显示出十分重要的生物活性，糖醛酸中半乳糖醛酸的含量最多。由于中性糖、糖醛酸并不是独立存在的，它们可能存在于同一糖链中，无法分离，在测定含量时可能存在相互干扰，有必要建立一种稳定准确的糖醛酸含量测定方法。常用方法有硫酸-咔唑法[5]、间羟基联苯比色法[6-7]、离子色谱法、气相分析和液相分析法[8]等。因色谱法对仪器要求较高且操作较为繁琐，相比前2种方法较为常用，间羟基联苯比色法试剂价格较高，咔唑-硫酸法测定多糖中半乳糖醛酸的含量较为常用[9-10]；采用清除羟基自由基、总还原力力、清除DPPH自由基、清除超氧阴离子自由基、清除ABTS自由基等5种方法来探究香菇多糖的体外抗氧化作用。国内外有许多对多糖中糖醛酸研究的文章，但未见有关对香菇多糖中半乳糖醛酸的含量测定及其抗氧化作用的研究报道，本文旨在为进一步开发香菇多糖提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

752紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；FA-2004型分析天平：上海菁海仪器有限公司；LDZ5-2型台式离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

鲜香菇：购自吉林省吉林市超市，经吉林化工学院薛建飞副教授鉴定；咔唑：Aladdin；半乳糖醛酸：国药集团；DPPH：Sigma进口分装；30%双氧水、邻二氮菲、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、三氯化铁、三氯乙酸、硫酸亚铁等试剂均为分析纯。

1.2 香菇多糖的提取与含量测定

取洗净的鲜香菇40 g，将其干燥后粉碎，加入800 g蒸馏水，在60℃恒温水浴下浸提3 h后过滤，浓缩，得香菇多糖浸膏4.0 g。采用苯酚-硫酸法测得多糖的得率为11.61%，纯度为10.28%。

1.3 糖醛酸的含量测定

采用上述方法提取多糖，然后进行糖醛酸含量测定条件的考察。

1.3.1 溶液的配制

对照品溶液：精确称取70℃干燥至恒质量的半乳糖醛酸对照品6.537 4 mg置于50 mL容量瓶中，以蒸馏水溶解定容，配成130.75 μg/mL的对照品溶液。

供试品溶液：精确称取同样条件下的香菇多糖0.100 0 g，配成2 mg/mL的多糖溶液。

硼砂-硫酸溶液：称取0.477 g硼砂加入浓硫酸100 mL，超声溶解，备用。

咔唑溶液：称取咔唑0.125 0 g，溶于100 mL无水乙醇中，配成1.25%的咔唑溶液备用。

1.3.2 测定波长的选择

分别吸取对照品溶液、供试品溶液1 mL，缓慢加入6 mL硼砂-硫酸溶液，且放于10 mL容量瓶中，振摇混合，然后至沸水浴中煮沸5 min，以冰水冷却至室温，加入0.125 mg/mL咔唑溶液0.2 mL，摇匀后在沸水浴中煮沸10 min，冷却后，以同样处理的重蒸馏水为空白，进行全波长扫描。

1.3.3 半乳糖醛酸最低检测限的测定

将1.3.1配制成的对照品溶液分别稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍，进行全波长扫描。

1.3.4 标准曲线的制备

分别精确吸取半乳糖醛酸对照品溶液2、3、4、5、6 mL于5个10 mL容量瓶中，加蒸馏水定容。取系列浓度半乳糖醛酸标准溶液1 mL，其余同1.3.2。

1.3.5 方法学考察

对半乳糖醛酸标准曲线进行精密度、稳定性、重复性、加样回收率等试验考察，之后测定香菇多糖中糖醛酸的含量。

1.4 抗氧化试验

1.4.1 清除羟基自由基能力的测定

取0.75 mmol/L邻二氮菲1 mL于试管中，依次加入PBS（pH 7.40）2 mL，蒸馏水1 mL，充分混匀后，加入0.75 mmol/L硫酸亚铁1 mL，混匀，加质量分数为 0.12%的 H2O21 mL，37℃水浴 60 min，在536 nm处测定其吸光度Ap；用蒸馏水代替H2O2，测定其吸光度Ab；取不同浓度的香菇多糖溶液代替蒸馏水1 mL，测定吸光度As[11]。

1.4.2 还原力的测定

依次在10 mL试管中加入不同浓度的香菇多糖样品溶液1.0 mL，磷酸盐缓冲溶液（pH=6.6）2.5 mL和1%铁氰化钾2.5 mL，置于50℃水浴中反应20 min，加入10%的三氯乙酸2.5 mL，混匀后以3 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，加入0.1%三氯化铁溶液0.5 mL和2.5 mL的蒸馏水，摇匀后在700 nm处测定吸光度，平行测定3次取平均值[12]。

1.4.3 清除DPPH自由基能力测定

取不同浓度的香菇多糖溶液2 mL，加入等体积的浓度为0.1 mmol/L的DPPH溶液，混匀后在室温下避光反应30 min，在517 nm下测定吸光度；空白对照组为2 mL DPPH溶液加上2 mL无水乙醇，在517 nm处测定吸光度，平行测定3次取平均值[13-14]。

1.4.4 清除超氧阴离子自由基能力的测定

取50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.20）4.5 mL,分别加入不同浓度的香菇多糖溶液1 mL，邻苯三酚0.2 mL，混匀后立即倒入比色皿，以等体积10 mmol/L盐酸代替邻苯三酚溶液为空白调零，在325 nm波长下每隔30 s测定一次吸光度，对照组以等体积去离子水代替样品溶液，平行测定3次取平均值[15-16]。

1.4.5 清除ABTS自由基能力测定

在试管中加入200 μL不同浓度的香菇多糖溶液和3 mL ABTS溶液，对照组用蒸馏水代替ABTS工作液，在室温条件下避光放置1 h，在波长734 nm处测吸光度[17]。

2 结果与分析

2.1 糖醛酸含量测定

2.1.1 测定波长的选择

扫描结果如图1所示，可知对照品和供试品溶液在528 nm处有最大吸收波长，峰型为正态分布曲线，因此选528 nm为测定波长。

2.1.2 半乳糖醛酸最低检测限的测定

扫描结果如图1所示，将1.3.1中的对照品溶液稀释32倍时（即质量浓度为4.086 μg/mL）目测出最低检测限。

2.1.3 标准曲线的制备

在n=5时，得到线性回归方程:y=0.013 0x+ 0.012 7，r=0.999 4。半乳糖醛酸含量在（26.15～78.45 μg/mL）之间呈良好的线性关系。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 精密度试验

取对照溶液在相同的操作条件下，连续操作6次，结果见表1。

图1 半乳糖醛酸和香菇多糖的全波长扫描图Fig.1 The full wavelength scanning of Galacturonic acid and lentinan

RSD为0.46%<1.0%，符合测定紫外分光光度计的要求，表明仪器精密度良好。

2.1.4.2 稳定性试验

为使分析方法可用于常规检验所规定的时间，以确保方法可行，考察稳定性，结果见表2。

RSD为0.40%<1.0%，表明溶液在80 min内显色稳定，可进行测定。

2.1.4.3 重复性试验

用规定的方法平行测定样本5份，结果见表3。

表1 精密度试验Table 1 The precision experiments

表2 稳定性试验Table 2 The stability experiments

表3 重复性试验Table 3 The repetitive experiments

RSD<1.0%，符合重现性的要求范围。

2.1.4.4 加样回收率试验

为考察其他成分对测定的干扰，按规定分析方法测定加样回收率，结果见表4。

RSD<1.0%，表明该标准曲线在允许的误差范围内。

表4 咔唑-硫酸法加样回收率试验(n=6)Table 4 The recovery experiments

2.1.5 2种方法测定多糖中半乳糖醛酸的含量

用硫酸-咔唑法与间羟基联苯法对香菇多糖中糖醛酸含量的测定结果如表5和表6所示。

由表5和表6可以看出，间羟基联苯法测定的平均回收率结果比咔唑-硫酸法的RSD值大，使用硫酸-咔唑法测定的结果与理论值接近。阿里红多糖中的糠醛酸含量，采用间羟基联苯法测定，回收率达到93.11%[8]。本文采用咔唑-硫酸法测定回收率达到103.87%，糖醛酸含量为30.25 μg/mg。

2.2 抗氧化试验

香菇多糖清除羟基自由基、总还原能力、清除DPPH自由基、清除超氧阴离子自由基、清除ABTS自由基的体外抗氧化活性结果见图2。

Vc在 5个体系的 IC50依次为 0.178、0.75、0.02、0.14、0.01。不同浓度香菇多糖对5种物质的清除能力在一定范围内与多糖质量浓度呈正相关性，其中羟基自由基超出本试验的IC50范围，还原力IC50为0.45，DPPH自由基为0.97，超氧阴离子自由基、ABTS自由基低于IC50，说明后2个体系抗氧化作用比较弱。在活性氧自由基中，羟自由基最活跃，可快速攫取多糖碳氢链上的氢与羟基结合成水；多糖结构中醇羟基可以与产生OH所必需的金属离子络合，使自由基的产生受到抑制，在试验中表现为抗氧化活性较强。

表5 咔唑-硫酸法加样回收率试验(n=4)Table 5 Carbazole sulfuric acid recovery test method(n=4)

表6 间羟基联苯法加样回收率试验(n=4)Table 6 M-hydroxyldiphenyl method recovery test

图2 香菇多糖的清除率Fig.2 The antioxidant activity of Lentinan

3 结论

本文采用水提法提取香菇多糖，以半乳糖醛酸为对照品，咔唑-硫酸比色法进行糖醛酸含量测定，得标准曲线为y=0.013 0x+0.012 7，r=0.999 4，最低检测限浓度为4.086 μg/mL，稳定性RSD值为0.34%，精密度RSD值为0.37%，重复性RSD值为0.29%，加样回收率RSD值为0.11%。同时也说明中性糖对测定结果的影响较小，试验测得香菇多糖中的糖醛酸含量为30.25 μg/mg。表明咔唑-硫酸法能够快速测定香菇多糖中糖醛酸的含量且准确度高、重复性好，适宜于香菇多糖中糖醛酸的含量测定。

系列抗氧化试验结果表明香菇多糖对5种体外抗氧化试验均有一定的作用，强弱顺序为：羟基自由基>总还原力>DPPH>超氧阴离子>ABTS，前2者的抗氧化能力比Vc强，具有很大的利用潜能，同时为香菇多糖的基础研究提供理论依据，但香菇多糖中糖醛酸与抗氧化作用之间的量效关系仍有待探寻。

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DETERMINATION AND ANTIOXIDATION ACTIVITY OF URONIC ACID IN POLYSACCHARIDES FROM LENTINAN

ZHAO Hepeng，XU Qiuda，CHANG Dan，ZHOU Hongli
（College of Chemical and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，China）

Lentinan has anti-tumor，anti-virus，improving the immune function and stimulating the formation of interferon and other functions The present study was to determinate the content of lentinanuronic acid and to examine the antioxidation activity of Lentinan.The content of uronic acids was determined according to the method of Carbazolesulfuric acid colorimetry and m-hydroxydiphenyl.The antioxidant effect of Lentinan was detected by scavenging hydroxyl radical，reducing power assay，DPPH radicals，superoxide anion free radical O2-，and ABTS radical method with VCas a positive control.The results showed that a good linearity relation was existed between the absorbency and the concentration of standard galacturonic acid in the range of 26.15～78.45 μg/mL(r=0.999 4)，and the average recovery was 99.87%，RSD was 0.11%，and the lowest detection limit was 4.086 μg/mL.The content of uronic acids in Lentinan was 30.25 μg/mg.The concentration of Lentinan in the range of 0.2～1.0 mg/mL had a certain antioxidant effect，which was in the order of scavenging hydroxyl radical，reducing power assay and DPPH radicals.The superoxide anion free radical and ABTS were not within the scope of IC50.It was concluded that the method of Carbazolesulfuric acid colorimetry and m-hydroxydiphenyl to determinate the lentinanuronic acid content in Lentinan was simple，available，accurate and reproducible，and the Lentinan had been proved to have certain antioxidation effect by 5 kinds of method.

lentinan；uronic acid；carbazole-sulfuric acid colorimetry；anti-oxidation activity

TS201.2

B

1673-2383(2017)02-00100-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170420.1409.034.html

2016-05-11

吉林省科技厅科研项目（20150311044YY）

赵鹤鹏（1988—），男，吉林吉林人，硕士研究生，主要从事天然有机化学的研究工作。

*通信作者