高效实用的组织芯片免疫组织化学对照体系的建立

陈杰伟，刘君，张淦梅，卢佳斌，杨远忠，廖定准，蔡木炎，肖永波*

（1中山大学肿瘤医院病理科，广州 510060；2佛山市第一人民医院病理科，佛山 528000）

技术方法

高效实用的组织芯片免疫组织化学对照体系的建立

陈杰伟1，刘君1，张淦梅2，卢佳斌1，杨远忠1，廖定准1，蔡木炎1，肖永波1*

（1中山大学肿瘤医院病理科，广州 510060；2佛山市第一人民医院病理科，佛山 528000）

目的开发一种高效实用的组织芯片对照体系应用于免疫组织化学质量控制。方法根据临床病理诊断的需求，以组织获取的难易程度、提高工作效率及实用性强为原则，运用组织芯片技术，设计多种对照组织芯片的微阵列，并用多种抗体测试验证。结果建立了5种组织芯片对照系统，可为约190种抗体的免疫组织化学染色提供相应的阳性和阴性组织对照片，其中1号芯片覆盖的抗体达80余种。结论科学合理设计和反复验证的组织芯片对照体系，组织耗费少、实用性强和效益高，可广泛推广应用于日常大规模的免疫组织化学质量控制工作中。

免疫组织化学；组织芯片；对照体系；质量控制

近年来，随着个体化诊疗时代的来临，精准医学的快速发展，免疫组织化学已成为病理医生不可或缺的辅助诊断手段。随着免疫组织化学染色过程逐步自动化，免疫组织化学在病理诊断中的作用日益广泛。如今，免疫组织化学技术已不仅仅用于判断肿瘤的来源、分类及鉴别诊断，而且广泛应用于检测相关指标来判断预后和指导临床个性化治疗[1-3]，因此其准确性和可靠性至关重要。尽管免疫组织化学染色在临床病理诊断的应用超过40年，但质量控制的标准化仍有待进一步完善，免疫组织化学染色过程中有很多因素可对染色结果产生不同程度的影响[4-7]。为了促进临床免疫组织化学标准化，提高染色结果的可靠性，每批次染色时都应该进行有效的质量控制，不可或缺的便是阴阳性对照的设立。只有设立适当的阴阳性对照才能确保免疫组织化学染色过程的准确性、抗体及相关试剂的有效性。下面介绍一种实用高效的免疫组织化学染色芯片对照体系。

材料与方法

1 材料

组织包埋石蜡(Paraplast，Leica)，熔点60℃。

组织芯片的组织来源：中山大学肿瘤医院病理科外科手术标本，组织离体0.5h内浸泡于相当于组织十倍体积的10%中性福尔马林固定时间24～48h，常规进行组织的脱水，浸蜡和包埋，取病理诊断明确的剩余的组织蜡块为供体蜡块。

受体蜡块制模器（图1A）和受体蜡块与组织芯融合器（图1B）由我们自行设计，分别用不锈钢和钢化玻璃加工而成；受体蜡块模具和组织芯片枪购自北京中杉金桥公司（Unitma-Quick-Ray，图1C）。

受体蜡块制模器上阵列排列有54个直经为1.5mm的针芯，用来制成含有54个孔径为1.5mm 的小孔的受体空白蜡块；受体蜡块和组织芯融合器上有两个孔位，可同时融合两个组织芯片蜡块，左右两个钢化玻璃片用于上下按压辅助融合；受体蜡块模具用于制作受体蜡模时辅助受体蜡块制模器定型蜡模；组织芯片点样枪用于从供体组织蜡块取样和向受体蜡块注芯。

图1 手工制作芯片的工具。A，受体蜡块制模器；B，受体蜡块和组织芯融合器；C，受体蜡块模具和组织芯片点样枪Fig. 1 The tools used for making microarrays manually. A, receptor parafn block molding machine; B, receptor parafn block and tissue core fusion machine; C, receptor parafn mould and tissue microarray sampler

2 对照组织芯片体系构建

根据使用频率和组织获取的难易程度来设计组织芯片的组织阵列，每种组织芯片尽量覆盖多种抗体，从而达到组织耗费少、方法操作简便、省时高效的目的。经过反复征求病理科医生意见和反复有效的验证，根据科室的实际情况，多次设计调整优化后，构建了5个系统化的对照组织芯片（图2）。

1号芯片：涵盖多种组织成分，包括不同的上皮组织、淋巴组织、肌肉组织、神经组织等，主要用于诊断淋巴、上皮、间叶和神经来源的肿瘤类抗体质量控制。

2号芯片：包括甲状腺癌、肺癌、胸腺瘤和胶质瘤的肿瘤组织，主要用于诊断这些肿瘤特异性比较高的抗体质量控制。

3号芯片：包括宫颈癌、乳腺癌、大汗腺癌、肝癌、卵巢浆液性癌等肿瘤组织主要用于诊断这些肿瘤特异性比较高的抗体质量控制。

4号芯片：包括恶性黑色素瘤、间质瘤和嗜铬细胞瘤肿瘤组织主要用于诊断这些特异性比较高的抗体质量控制。

5号芯片：包括间皮瘤、精原细胞瘤、霍奇金，间变，NK淋巴瘤等肿瘤组织主要用于诊断这些肿瘤特异性比较高的抗体质量控制。

除上述5种组织芯片外，还构建了一些只为一种抗体提供特定组织对照片的单点对照或三点对照，因为这些抗体的阳性组织较难获取或者这是一种需要定量分析的抗体，尤其是靶向药物的单克隆抗体需要独立质量控制，如Her-2对照组织芯片上的三个点分别为待测抗体阴性、中等强度阳性和强阳性的组织，MyoD1, Myogenin等用于鉴别诊断少见病例的抗体也常采用单点对照，避免与其他抗体组织对照放在一起造成浪费。

构建的组织芯片为常用抗体质量控制设置了阳性对照及阴性对照，每个对照芯片进行相应抗体的染色后至少能观察到一个位点的组织有阳性表达，其余的位点就可作为阴性对照。

3 收集质量控制抗体相应的阳性组织蜡块

根据上述设计好的组织阵列，收集相应的阴阳性对照组织蜡块并在这些供体蜡块上圈出阳性区域。1号芯片所需的组织蜡块需要进行切片并行HE染色后，在镜下观察组织形态并圈出符合要求的部位，例如：肺组织要有正常的肺泡结构，扁桃体组织要有被覆的鳞状上皮及淋巴小结，甲状腺组织要有正常滤泡结构，肾组织要有肾小管，子宫组织要有子宫内膜层或肌层，结肠组织要有黏膜层，阑尾组织要有大肠腺和淋巴小结，胎盘组织要有绒毛结构，并一律避开坏死和钙化的区域。其余4种芯片对应的组织蜡块经过切片和对应质量控制的抗体免疫组织化学染色后，在镜下比对选定阳性部位并在切片上画圈标记，然后比对蜡块的相应位置并圈出。这些工作由质量控制小组（由病理医师和技术人员组成）一起完成。

4 受体蜡块的制作

将石蜡放置在65℃烤箱中60min，达到熔融状态取出并注入固定在受体蜡块制模器上的模具内，制成含有孔径为1.5mm小孔的空白蜡块(图3A)。

5 组织芯的取样与填充组织

用组织芯片点样枪取供体蜡块上标记好的目标组织，注意避开钙化点及坏死处。取样时芯片枪的针头垂直于蜡块加压，拔出后慢推芯片抢的内芯将蜡块组织芯注入受体蜡块孔中。同一受体蜡块的各位点的组织芯长度应相当，如果某个位点的组织芯长度与其它位点相差大，可在同一供体蜡块取两块组织芯叠在一起。按预先设计好的芯片阵列填充完所有的组织后，向受体蜡块的背面填补烤软的石蜡，空白孔也须填充石蜡，以防蜡块组织芯与受体蜡块融合时蜡块变形而导致组织移位。

图2 5个对照组织阵列Fig. 2 Five tissue microarray control systems

6 蜡块组织芯与受体蜡块的融合及组织芯片的蜡块包埋

将做好的蜡块放入玻璃模具内，并用两块干净玻璃夹住蜡块置于65℃烤箱15min，使蜡块成微熔融状态；取出后双手均匀用力按压上下两块玻璃，将蜡块压平、压实，并放入冰水中冷却，蜡模凝固后玻璃模具中取出（图3B）。

将融合好的多组织蜡块稍稍烤软，然后按预先划分好的线分割出相应的组织芯片蜡块，每个组织芯片蜡块单独用包埋盒包埋成型（图3C）。

7 组织芯片蜡块有效性检测、组织芯片切片与保存

每个组织芯片蜡块切片后进行相应抗体的免疫组织化学染色，由质量控制小组阅片，确定抗体染色的特异性及阳性染色信号定位，从而确定制成的组织芯片蜡块是否可用于对照的抗体的实际有效种类，并做好记录。

对组织芯片进行连续地切片，置于40℃的温水中展片，随后裱于干净的防脱载玻片上端或者下端（图3D），标明组织芯片的类型，60℃的烤箱中1h，室温或4℃保存；切片量最好是一周之内用完，最长不超过一个月，否则部分不稳定抗原的丢失较严重。

结 果

1 成功构建了5个高效实用的阴性阳性对照组织芯片体系

5个对照芯片体系经过两年时间、中山大学肿瘤医院诊断的近5万个病例、约30万张检测片应用，反复有效的验证可为190多种抗体提供稳定可靠的阴阳性组织对照片，其中，1号芯片覆盖的抗体范围达80余种，覆盖了部分淋巴瘤，上皮和间叶来源肿瘤的鉴别诊断抗体对照；2号芯片为临床病理诊断提供了甲状腺癌、常见类型肺癌、胶质瘤、胸腺瘤的鉴别诊断抗体对照；3号芯片提供了乳腺癌、宫颈癌、肝癌、卵巢癌相应的鉴别诊断抗体对照；4号芯片提供了恶性黑色素瘤、间质瘤、神经内分泌肿瘤的鉴别诊断抗体对照；5号芯片提供了前列腺癌、精原细胞瘤、间皮瘤、霍奇金淋巴瘤、NKT淋巴瘤、间变淋巴瘤的鉴别诊断抗体对照（表1）。

图3 组织芯片制作步骤示意图。A，用图1A模具制作的带有1.5 mm直径小孔的受体蜡块；B，含有组织芯的受体蜡块；C，分割并包埋后的组织芯片对照蜡块；D，裱于玻片上的对照组织芯片Fig. 3 Fabrication of tissue microarrays. A, a receptor parafn block with holes of 1.5mm diameter made with the molding machine indicated in Figure 1A; B, receptor parafn blocks containing tissue cores; C, segmented and embedded tissue microarray control parafn blocks; D, control tissue chips mounted on slides

表1 组织芯片各点组织的抗体阳性表达对照情况Tab. 1 Positive antibody expression specific to each tissue spot on the microarrays

图4 1号组织芯片对照免疫组织化学染色举例。A，扁桃体组织的LCA细胞膜阳性；B，阑尾组织的LCA细胞膜阳性；C，肺组织的TTF-1细胞核阳性；D，甲状腺组织的TTF-1细胞核阳性；比例尺，100μmFig. 4 An example of immunohistochemical staining on No. 1 tissue microarray. A, tonsil tissue∶ LCA positive in cell membrane; B, appendix tissue∶LCA positive in cell membrane; C, lung tissue∶ TTF1 positive in the nucleus; D, thyroid tissue∶ TTF1 positive in the nucleus; scale bar, 100μm

2 几乎全覆盖的芯片对照系统从多角度有效提高了质量控制水平

5个对照芯片体系基本覆盖了临床常用诊断抗体，每种抗体加了芯片对照可以在日常质量控制中很容易找到并排除失控（假阳性和假阴性）的原因，有效地推动了实验室自动化和标准化进程。因为是多点控制，每种抗体有了阳性对照的同时也自动具备阴性对照；而且，还可观察到同一抗原在同一种组织芯片上的不同组织中表达。例如，在应用1号芯片作为质量控制时，LCA不仅表达于扁桃体，还表达于阑尾；TTF-1不仅表达于肺上皮而且表达于甲状腺的上皮（图4）。同样，也可以观察到多种抗原表达于同一组织：扁桃体组织中，在上皮细胞胞质可见CK、CK5/6、EMA等阳性表达；血管肌层可见SMA、HHF35、Calponin等阳性表达，间质细胞胞质可见Vimentin等阳性表达，滤泡周围副皮质区可见CD3、CD4、CD5、CD8等阳性表达，血管内皮可见CD31、CD34，淋巴管内皮可见D2-40、Factor Ⅷ等阳性表达，淋巴结滤泡生发中心可见LCA、CD20、CD79α、CD10、 CD21、CD23等阳性表达。

讨 论

为了保证病理诊断中免疫组织化学结果的可靠性，每批次染色无论手工操作还是自动化都应进行有效的质量控制。设立适当稳定的对照并且合理地应用则是质量控制的关键步骤，是对免疫组织化学染色过程的准确性、抗体及相关试剂的有效性进行有效的控制，进而有利于医生对染色结果的正确判断，有利于病理诊断的准确性。

免疫组织化学染色对照包括阳性组织对照、阴性组织对照、阴性试剂对照和内部对照[10-11]。一般来说，不需要专门设立阴性组织对照，而且，阳性对照组织芯片已包含其阴性组织。阴性试剂对照是针对内源性的生物素而设立的对照，由于应用聚合物类检测系统的染色程序，如果完成了最初的校验，可以取消阴性试剂对照[11]。内部对照通常是被测试组织中的正常细胞，例如，正常的上皮细胞，内皮细胞，肌纤维等，内部阳性对照可用于确认包括组织固定包埋等在内的所有步骤的可靠性[6,8]。虽然本文所介绍的阳性对照设立可广泛应用于免疫组织化学染色对照，却不能监控标本的前处理（包括固定），内部阳性和阴性对照便是克服这一弱点的最佳选择，甚至其抗原含量可以进一步用于定量免疫组织化学[6,8,9,10]。内部阴阳性对照是每一张被测试的组织切片上都存在的细胞成分，它是目前比较可行的一种评价标本制备和定量免疫组织化学方法[6,9]。

理想的阳性对照材料应符合以下要求：①与待测组织切片的标本制备过程完全等同，包括组织的固定包埋等处理程序；②与待测的组织切片一起进行免疫组织化学染色的全过程；③含有已知的阳性待测分析物；④廉价并可无限量提供；⑤普遍通用性[8]。目前尚未找到这样的标准对照材料。随着科学技术的发展，出现了一些新的阳性对照材料来源，包括细胞系、异种移植物、工程化多肽，由于技术原因目前还不能大规模地应用于临床实践中[13]。这些新的材料来源也许能提供更为标准的对照过程，减轻病理科日常工作量，提高工作效率。但目前较难推广，原因之一就是每个单位的组织固定处理方法没有达到一致或标准化。免疫组织化学对照研究进展缓慢，很重要的原因之一就是组织固定等前处理的标准化还没完全有效的推进，因而抗原修复的标准化也远没达到一致的要求。

目前，在免疫组织化学染色中使用多组织对照是最有保证的质量控制方法，它是一种比较节省且有效的方法，将多种不同的组织制成多组织对照蜡块，并在切片后与待测病例组织放在同一张玻片上，与待测病例组织进行完全相同的免疫组织化学染色过程。应用较为广泛的多组织蜡块制作方法包括，“香肠”蜡块技术、组织芯片技术和三点组织对照技术[14-17]。“香肠”蜡块技术无需特殊仪器，全手工操作，适用于所有的免疫组织化学实验室，在病理实验室中应用较为广泛，但是“香肠”法制作过程较为复杂，须从新鲜标本开始，需要较长时间，制作所需组织较多。而本文中所用的组织芯片技术具有以下优点：①组织可以从石蜡包埋组织上获取，对照组织与待测病例组织的前处理有较好的一致性；②所需组织少，1.5mm的组织即足够；③每例芯片上组织获取的难易程度和使用频率相近，减少使用过程中组织的耗费；④利用组织芯片仪，操作易学简单方便，效率高。目前，阳性对照的材料来源主要是病理诊断明确的剩余的组织蜡块。由于组织来源有限，新兴的免疫组织化学对照材料(细胞，工程多肽等)开发仍不具规模，组织芯片对照技术相对于“香肠”蜡块技术来说更具优势。同时，组织芯片技术也有一定的局限性，因其需要一些特殊的工具。另外，存在阳性区域不同深度层次分布不均等问题，在切到较下层面时，阳性区域和阳性细胞就会急剧减少，甚至是阴性，所以制作好的组织芯片切到一定数量后需要再次验证芯片切片上的阳性区域是否还存在以及面积的大小。

本研究所设计的组织芯片可根据各个层次的医院临床病理需求进行有效的组合，可操作性强，各个单位能灵活效仿应用；同时也致力为病理室间质量控制提供免疫组织化学熟练水平测试的材料，从而提高整个病理免疫组织化学技术的质量控制水平。

总之，经过科学合理设计的免疫组织化学组织芯片对照片组织耗费少、实用性强和效益性高，操作简单，易学，质量稳定可靠，可广泛应用到日常大规模的免疫组织化学质量控制工作，为免疫组织化学室内及室间质量控制带来极大的稳定和便利。

致谢：中山大学肿瘤医院病理科医生和技术团队在本研究过程中为阅片和设计制作提供有益的付出和建议，在此表示感谢！

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Development of a practical and effective tissue microarray system for immunohistochemical quality control

Chen Jiewei1，Liu Jun1，Zhang Ganmei2，Lu Jiabin1，Yang Yuanzhong1，Liao Dingzhun1，Cai Muyan1，Xiao Yongbo1＊
(1Department of Pathology,SunYat-Sen University Cancer Center, Guangzhou, 510060;2Department of Pathology, The First People,s Hospital of Foshan, Foshan,528000)

ObjectiveTo develop a practical and efective tissue microarray system for immunohistochemical quality control.MethodsA variety of tissue microarray control systems were designed based on clinicopathological diagnostic requirements and the difculty of obtaining tissue, and were tested with various antibodies.ResultsThe fve systems developed in this study can provide positive and negative controls for immunohistochemical staining of more than 190 antibodies, over 80 of which are included in No.1 microarray alone.ConclusionBy proper design and repeated validation, the tissue microarray control systems developed in this study have the advantages of low tissue consumption, good practicability and high efciency, and are widely applicable in the quality control in large-scale immunohistochemical routine.

Immunohistochemistry; tissue microarray; control system; quality control

R392-33

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.02.013

2016-11-18

2017-03-26

2015中大青年项目（520101210104）

陈杰伟，男（1984年），汉族，主管技师

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：xiaoyb@sysucc.org.cn