Cdc25C在放疗敏感的食管鳞状细胞癌中高表达

李多杰，吴礼高，朱超莽，汪朝歌，李艳，李梦茹

(蚌埠医学院第一附属医院1放疗科，2病理科，蚌埠 233003)

Cdc25C在放疗敏感的食管鳞状细胞癌中高表达

李多杰1，吴礼高2*，朱超莽1，汪朝歌1，李艳1，李梦茹1

(蚌埠医学院第一附属医院1放疗科，2病理科，蚌埠 233003)

目的研究食管鳞状细胞癌组织中Cdc25C的表达与放疗敏感性的关系。方法回顾性分析62例根治性放疗的局部晚期食管鳞状细胞癌患者，根据放疗近期疗效分为放疗敏感组和放疗不敏感组，采用免疫组织化学检测放疗前食管癌组织中Cdc25C表达，分析Cdc25C的表达与放疗敏感性之间的关系。结果食管鳞状细胞癌组织中Cdc25C表达率显著高于癌旁正常上皮组织，放疗敏感组Cdc25C表达率显著高于放疗不敏感组。结论食管鳞状细胞癌组织中Cdc25C高表达与放疗敏感性密切相关，Cdc25C的高表达可能有助于预测肿瘤细胞对放射治疗的敏感性，对于指导食管鳞状细胞癌临床治疗具有重要的参考意义。

食管；鳞状细胞癌；Cdc25C表达；放射敏感性

根治性放化疗或新辅助放化疗联合手术治疗是局部晚期食管鳞状细胞癌（简称鳞癌）患者主要的治疗手段，放疗敏感性是决定放化疗疗效的主要因素。辐射条件下肿瘤细胞通过细胞周期阻滞而逃避射线“打击”是造成辐射耐受的主要原因，选择性地解除G2/M期阻滞是食管癌放疗增敏的新途径[1]。细胞分裂周期25 (cell division cycle 25, Cdc25) 磷酸酶通过去磷酸化和激活细胞周期依赖酶促进细胞周期进行，其家族包括Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C 3种亚型，Cdc25A 在G1 向S 转换激活CDK2，在G2 向M 期转换激活CDK1，在胚胎发生和肿瘤发生中起到重要作用；Cdc25B磷酸酶在G2/M期转换过程中可使Cdc2 激酶去磷酸化, 起激活M 期促进因子的作用， 是早期有丝分裂的启动因子；Cdc25C在真核细胞有丝分裂中起重要调节作用，是辐射条件下调控G2/M期转换的核心因子[2]。本研究拟采用免疫组织化学法检测62例食管鳞癌中Cdc25C蛋白的表达水平，并分析其与放疗敏感性的关系，探讨Cdc25C表达在预测食管鳞癌放疗敏感性中的价值，为食管鳞癌治疗方案的选择和放疗预后判断提供新的指标。

材料和方法

1 患者资料

回顾性分析2014年6月至2015年6月在蚌埠医学院第一附属医院放疗科行根治性放疗的食管鳞癌患者62例，男41例，女21例，年龄45～78岁，中位年龄52岁；组织学分级为I+II级36例，III级26例；按照放疗前食管钡餐诊断，病变长度＜5 cm 33例，≥5 cm 29例；根据增强胸部CT或颈部彩超结果，无淋巴结转移41例，有淋巴结转移21例。所有病例均为医学原因不能手术或患者拒绝手术，签署放化疗知情同意书后，采用5野简化调强同步加量放疗，PGTV 60-64 Gy/30-32F，PTV 50-54 Gy/30-32F，每周5次，54.84%（34例）患者完成同步化疗。所有患者在接受根治性放疗前均未接受化疗及免疫治疗，且具有完整的临床、病理及随访资料。随访时间截至2016年12月31日，随访时间为19-31个月，中位随访时间为16.5个月，失访6人，随访率为90.3%。收集这62例临床病理科存档石蜡包埋食管鳞癌组织和20例距离癌组织2cm以上切缘正常鳞状上皮组织，该研究在实施过程中得到患者及蚌埠医学院第一附属医院人体试验伦理道德委员会同意。

2 ElivisionTMplus法免疫组织化学染色

Cdc25C抗体（兔单克隆抗体E302）购自美国Abcam公司；ElivisionTMplus试剂盒和DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。组织用4%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，连续制成4 μm 厚的切片，并在65℃ 烤片30min，依次脱蜡、水洗、与第一抗体(Cdc25单克隆抗体)及第二抗体（ElivisionTMplus试剂）孵育， DAB显色、用苏木素复染细胞核、封片。Cdc25C 抗体按1 ∶ 400 稀释，所有切片用第一抗体封闭后在4℃过夜，第二抗体37℃孵育时间为30min。用已知阳性片作对照，用PBS 缓冲液代替第一抗体做阴性对照。

3 免疫组织化学结果判定

Cdc25C阳性染色主要定位于细胞核中，呈棕黄色，背景不着色。表达结果按照着色强度和着色范围综合计分。着色强度：无色，0分；淡黄色，1分；棕黄色，2分；棕褐色，3分。着色范围（计数高倍镜下阳性细胞所占百分比）：＜10%，1分；11%～50%，2分；51%～75%，3分；＞75%，4分。将着色强度得分和范围得分的乘积作为判断结果，若积分=0为阴性表达，≥1为阳性表达，若积分≥1且≤2为低表达，≥3为高表达。每例标本均随机计数10个高倍视野（40倍物镜），取其中位值。结果最后由两位病理医师采用独立双盲法阅片判定。

4 近期疗效评价

放疗结束后4周行食管钡餐造影和胸部CT检查进行近期疗效评定，疗效评价标准参照万均等[3]食管癌放疗后近期疗效评价标准，将放疗结束时食管钡餐造影和胸部CT检查结果分为完全缓解（complete response, CR）即肿瘤完全消失，食管片边缘光滑，钡剂通过顺利，但管壁可稍显强直，管腔无狭窄或稍显狭窄，粘膜基本恢复正常或增粗；部分缓解（partial response, PR）即病变大部分消失，无明显的扭曲或成角，无向腔外溃疡，钡剂通过尚顺利，但边缘欠光滑，有小的充盈缺损及/或小龛影，或边缘虽光滑，但管腔有明显狭窄；无缓解（no response, NR）即放疗结束时，病变有残留或看不出病变有明星好转，但仍有明显的充盈缺损及龛影或狭窄加重。本研究CR+PR患者定义为放疗敏感，NR患者定义为放疗不敏感。所有病例在放射治疗结束后一年内每2个月随访1次，一年以上每3个月随访1次，随访内容包括食管钡餐检查、胸部CT、腹部彩超等，必要时增加ECT骨扫描、PET-CT等检查。

5 统计学分析

所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析，食管癌组织和癌旁正常组织中Cdc25C蛋白表达的差异采用χ2检验，Cdc25C蛋白表达与各临床病理参数及放疗敏感性之间的关系进行χ2检验。以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Cdc25C在食管鳞癌的高表达率高于癌旁正常上皮组织

Cdc25C阳性染色主要定位于细胞核中，在癌旁组织中，仅部分细胞出现弱阳性反应，着色浅；而在食管鳞癌中，大量细胞呈强阳性反应，着色深（图1）。在食管鳞癌中，Cdc25C的总阳性表达率为87.10% (54/62)；食管鳞癌中Cdc25C免疫反应高表达率为77.42% (48/62)，明显高于癌旁正常组织中的高表达率25.00% (5/20)， 差异有统计学意义（χ2=3.965，P=0.042）。

2 放疗敏感食管鳞癌组织中Cdc25C免疫反应性更强

62例患者全部采用5野简化调强同步加量常规分割放疗，放疗后4周根据影像学表现进行疗效评价。放疗敏感组41例患者中，Cdc25C高表达率90.24%（37/41）；放疗不敏感组21例患者中，Cdc25C高表达率为52.39%（11/21），两组之间Cdc25C高表达率比较差异具有显著性意义（表1）。

表1 Cdc25C表达水平与食管癌放疗敏感性的关系Tab. 1 The relationship between Cdc25C level and ESCC radiosensitivity

图1 食管癌鳞癌组织Cdc25C表达的免疫组织化学检测。A，癌旁正常鳞状上皮组织Cdc25C免疫反应阴性；B，食管鳞状细胞癌组织弱Cdc25C免疫反应性；C，食管鳞状细胞癌组织强Cdc25C免疫反应性；比例尺：Al、Bl和Cl，100μm；A2、B2和C2，100μmFig. l Immunohistochemical detection of Cdc25C expression in ESCC. A, negative Cdc25C immunoreactivity in normal squamous epithelial tissue; B, weak Cdc25C immunoreactivity in ESCC；C, strong Cdc25C immunoreactivity in ESCC; scale bar, 100μm in Al, B1 and C1; 100μm in A2, B2 and C2

讨 论

我国食管癌患者约占全世界的70%，其中约95%的食管癌病理类型为鳞状细胞癌。由于食管癌早期症状不典型，确诊时约60%～70%的患者属于中晚期，失去最佳手术治疗机会。根治性放化疗或新辅助放化疗联合手术治疗是这类患者主要的治疗手段。放疗敏感性是决定放化疗疗效的主要因素，文献报道局部晚期食管癌放射治疗3年生存率为15%～23%[4-5]，也有许多放疗敏感的局部晚期食管癌患者接受根治性放疗后得以长期生存[6]。新辅助放化疗联合手术治疗的经验也表明，对放疗敏感的食管癌患者接受新辅助放化疗后达到病理学完全缓解是预后良好的独立预后因子[7]。因此提高食管癌的放疗敏感性，进而提高其局部控制率及临床治愈率，是食管癌放疗研究的热点。

提高食管癌的放疗敏感性一直是食管癌放射生物学研究的热点，但是既往研究在肿瘤放疗增敏的同时，正常组织也同样增敏而受到损伤，大多数研究结果因毒副作用较大不能用于临床。如果能够从分子机制上利用肿瘤组织和正常组织对辐射反应的差别，去选择使肿瘤得到增敏而正常组织不致因受辐射而过度损伤，将是食管癌放疗增敏的有效研究方向。Cdc25是细胞周期转换的重要因子，通过去磷酸化和激活细胞周期依赖酶促进细胞周期进行，其家族包括Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C三种亚型，Cdc25A 在G1 向S 转换激活CDK2，在G2 向M 期转换激活CDK1，Cdc25A 在胚胎发生和肿瘤发生中起到重要作用，Cdc25B磷酸酶在G2/M期转换过程中可使Cdc2 激酶去磷酸化, 肩负激活M 期促进因子的重大责任, 是早期有丝分裂的启动因子。Cdc25C在真核细胞有丝分裂中起重要调节作用，在细胞有丝分裂过程中，Cdc25C通过去磷酸化活化细胞周期蛋白B/ CDC2复合体，使细胞顺利通过G2期“关卡”，进入M期[2]。P53突变的食管癌细胞受到放射线损伤以后主要通过G2/M期阻滞进行修复损伤，Cdc25C的数量或活性是癌细胞通过G2/M期的关键因子，因此，干预Cdc25C可能会改变食管癌放疗敏感性。在不同辐射剂量引起人肝癌细胞株HepG2低剂量超敏和辐射抵抗的研究中[8]，当辐射剂量为0.05Gy的低剂量辐照并不影响Cdc25C活性，细胞放射生物学行为表现为低剂量超敏，而辐射剂量增大为0.5Gy或2Gy辐射水平，磷酸化Cdc25C(S216)则表达显著上调，且磷酸化Cdc25C(S216)在放疗16小时后达到最高水平，这与G2/M阻滞程度完全一致，这是肿瘤细胞在辐射条件下发生辐射抗性的主要原因。提高Cdc25C活性，选择性解除G2/M阻滞可能是提高放疗敏感性的重要途径[1]。

本实验表明，Cdc25C的表达高低，对食管鳞癌放疗敏感性有明显的影响，放疗敏感组Cdc25C高表达率明显高于放疗不敏感组，推测可能是过表达的Cdc25C对抗了辐射诱导的G2/M期阻滞，使肿瘤细胞没有损伤修复机会，但具体机制有待进一步研究。Li等[9]应用免疫组织化学方法检测接受术前放疗的局部晚期食管鳞状细胞癌患者肿瘤组织中CHK2、Cdc25C与CyclinD1表达的研究发现：肿瘤组织过表达Cdc25C可以提高接受术前放疗的局部晚期食管鳞状细胞癌患者的总生存率，并且过表达Cdc25C与放疗后肿瘤病理缓解率显著相关，该研究结果提示：过表达Cdc25C的食管鳞癌对放疗更敏感，肿瘤组织Cdc25C表达水平可作为食管鳞癌放疗敏感性及预后的一个预测因子。Cdc25C的功能也与其他肿瘤的放疗敏感性密切相关，田允鸿等[10]的研究表明MCF-7细胞系中乳腺癌干细胞放疗前后G2期细胞含量分别为22.03%+2.12%和45.83%+2.25% (P＜0.01)，G2期相关蛋白pCdc25C(ser2l6)放疗后表达明显增高，故认为放疗后出现的G2/M期阻滞是与其放疗抵抗特性紧密相关的。Gogineni等[11]研究表明，不可逆的G2/M期阻滞导致了脑膜瘤细胞的放射抵抗，原因在于CHK2的激活导致的Cdc25C及Cdc2磷酸化和细胞周期蛋白B1/Cdc2复合物功能抑制，改变这一通路的关键环节可以改变肿瘤细胞的放疗敏感性。

影响食管鳞癌放疗敏感性的因素众多，机制复杂。Cdc25C可能在食管鳞癌的发生、发展及组织分化过程中起重要作用， Cdc25C高表达的食管鳞癌可能对放疗更敏感，但具体机制有待进一步研究证实，Cdc25C有望成为食管鳞癌放疗敏感性预测的重要指标。

[1] Li J, Yang CX, Mei ZJ, et al. Involvement of Cdc25c in CellCycle Alteration of a Radioresistant Lung Cancer Cell Line Established with Fractionated Ionizing Radiation. Asian Pac J Cancer Prev, 2013, 14(10)∶ 5725-5730.

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[9] Li BZ, Chen ZL, Shi SS, et al. Over expression of Cdc25C predicts response to radiotherapy and survival in esophageal squamous cell carcinoma patients treated with radiotherapy followed by surgery. Chin J Cancer, 2013, 32(7)∶ 403-409.

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[11] Gogineni VR, Nalla AK, Gupta R, et a1. Chk2-mediated G2/M cell cycle arrest maintains radiation resistance in malignant meningioma cells. Cancer Lett, 2011, 313(1)∶ 64-75.

High expression of Cdc25C in radiosensitive esophageal squamous cell carcinoma

Li Duojie1, Wu Ligao2*, Zhu Chaomang1, Wang Chaoge1, Li Yan1, Li Mengru1
(1Department of Radiotherapy,2Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233003，China)

ObjectiveTo study the expression of Cdc25C protein in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and its relationship with the radiosensitivity of ESCC.Methods62 cases of locally advanced ESCC having

radical radiotherapy were retrospectively analyzed and divided into a radiosensitive group and a radio-insensitive group according to the short-term efect of radiotherapy. The expression of Cdc25C in the cancer tissue before radiotherapy was detected by immunohistochemistry, and its relationship with radiosensitivity analyzed.ResultsThe rate of Cdc25C high expression was signifcantly higher in the cancer tissue than in adjacent normal epithelial tissue, and in the radiosensitive group than in the radio-insensitive group.ConclusionCdc25C high expression in ESCC is closely related to and may help predict the radiosensitivity of ESCC, which provides important reference for ESCC treatment.

Esophagus; squamous cell carcinoma; Cdc25C expression; radiosensitivity

R730.5

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.02.009

2016-12-12

2017-03-27

安徽省高等学校自然科学研究项目

（KJ2017A218）；安徽省卫生厅“十二五”临床重点专科建设基金资助（01Z33）

李多杰，男（1973年）汉族，副教授

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：wlgahbb@126.com