不同层积条件下老山芹种子形态后熟的研究

李富恒，李楠丁，刘增兵，崔巍金琦，Брыксин Д М，于萍，徐庆华

（1.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030；2.俄罗斯全俄米丘林园艺研究所，米丘林斯克市393774）

不同层积条件下老山芹种子形态后熟的研究

李富恒1，李楠丁1，刘增兵1，崔巍金琦1，Брыксин Д М2，于萍1，徐庆华1

（1.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030；2.俄罗斯全俄米丘林园艺研究所，米丘林斯克市393774）

以老山芹种子为试验材料，研究低温及变温层积处理对种子形态后熟过程影响，为揭示老山芹种子休眠机理，终止种子休眠提供依据。结果表明，两种层积处理种胚胚长、胚宽、胚剖面面积及胚率等指标均随层积时间延长不断增加，而胚附近胚乳空腔面积在层积过程中随着种胚逐渐增大而减小；变温层积处理效果优于低温层积处理。变温层积可加速老山芹种子后熟过程，缩短种子休眠时间。

老山芹；种子；层积处理；形态后熟

老山芹（Heracleum moellendorffii Hance）学名东北牛防风，又称短毛白芷和大叶芹等[1]，系伞形科牛防风属多年生宿根草本植物，为黑龙江东北林区常见山野菜种类之一。老山芹为耐阴植物，自然条件下多生长于河岸湿草地、草甸子、山坡针阔叶混交林及杂木林下等阴湿环境，喜富含腐殖质的砂质土壤[2]。老山芹营养丰富，含蛋白质、脂肪、糖及维生素C。老山芹全株可入药，有祛风除湿、退热解毒、清洁血液、降糖降压等功效[3]。

野生老山芹采收无法满足市场需求，老山芹人工种植，对实现林业经济结构调整和转型具有重要意义。老山芹在山上及林下等阴湿环境，自然繁殖量较低，种子具有休眠特性，野生老山芹种子成熟后落地，第二年春天发芽[4]，存在种子发芽率低、催芽难度大、出苗不整齐等问题，制约老山芹生产。植物种子成熟时胚尚未形成，或胚己形成但未分化尚处于原胚阶段，或胚己分化但生理未成熟，需一定温度和时间促进胚形成或原胚分化，种子仍继续保持休眠状态，即“胚后熟休眠”[5]。植物胚后熟研究多针对药用植物，如东北红豆杉[6]、三七[7]、人参[8]、西洋参[9]、刺五加[10]、东北刺人参[11]等，层积过程中老山芹胚后熟方面研究鲜有报道。目前老山芹研究多集中于植株及种子生长发育特性[12]、栽培技术[13]、化学成分分析[14]等方面。因此，老山芹种子形态后熟研究十分必要。

本研究以四年生老山芹植株种子为试验材料，作低温和变温层积处理，定期取样观察层积过程中种胚发育情况、测定其形态指标，分析形态指标动态变化规律及其与种子后熟关系，为终止老山芹种子休眠、发展老山芹产业提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

选取中国科学院东北地理与农业生态研究所（哈尔滨市）试验田四年生老山芹植株种子。

1.2 方法

1.2.1 层积方法

采用低温和变温层积两种方法。

取干净细砂，挑出杂质，于100℃烘箱中高温灭菌3 h，取出加水搅拌均匀含水量以手握成团但不滴水、一触即散为准。挑选籽粒饱满种子分装于纱布袋中。

将纱布种子袋放入盛有湿沙塑料发芽盒（长19 cm×宽13 cm×高11 cm）中，盖上打孔以利空气交换，按如下层积方案操作。

低温层积：层积过程中温度始终保持4℃；变温层积：20℃·20 d-1→4℃·20 d-1→-20℃·5 d-1→4℃·30 d-1→20℃·25 d-1。

每隔5 d取种，清水冲洗后放回发芽盒继续层积，每隔30 d更换一次湿沙。

每隔20 d定期取样一次。

1.2.2 种胚形态指标测定

定期选取籽粒饱满体积接近的不同层积处理种子，刀片切开，徒手切片法制作临时装片，显微镜下利用直线式和网格式测微尺测量种胚形态指标并显微摄影。测量指标包括胚长、胚宽、胚剖面面积、胚附近胚乳空腔面积和胚乳长。重复测量10次，取平均值，计算胚率。

胚长=直线测微尺测量种胚剖面长度最大值；胚宽=直线测微尺测量种胚剖面宽度最大值；胚剖面面积=网格测微尺测量所有种胚剖面覆盖面积总和；

胚附近胚乳空腔面积=网格测微尺测量所有空腔覆盖面积总和；

胚率计算公式：胚率（%）=胚长（mm）/种子长（mm）×100%[11]

测微尺校正：将目微尺置于目镜内，台微尺放在显微镜载物台上。移动台微尺至两尺平行，起始线重合，确定另一两尺刻度重合处。记录起始线到重合线间各尺刻度（格数），按下式计算该放大倍数下目微尺每格代表实际长度:

目镜测微尺每格代表实际长度=（台微尺格数/目微尺格数）×10 μm。

1.2.3 数据分析

运用Excel 2003和SPSS 22.0软件作数据处理与分析。不同大写字母表示极显著水平（P＜0.01）；不同小写字母表示显著水平（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 老山芹种胚发育进程

老山芹种子层积后熟期间切片照片（见图1），在层积过程中老山芹种子胚从最初种子采收时心形胚阶段（图1A），逐渐过渡到心形胚后期（图1B）、鱼雷形胚（图1C、D）和马蹄形胚阶段（图1F）。说明植株成熟时采收的种子种胚尚未发育完全，需经过层积完成种胚发育过程。但观察装片发现，同一时期取样观察的不同种子，其种胚发育状态差别较大，说明种子成熟度不一致。伞形科植物种子逐渐成熟，采收过程要注意成熟、采收原则，保持种子成熟度一致，有利于种子处理及育苗管理。

2.2 不同层积条件对种子后熟期间种胚生长发育影响

老山芹为双子叶植物，通过解剖观察发现，为典型带胚乳种子，采收后种子内胚乳占据绝大部分体积，而胚很小，尚未发育完全。图1A-F为低温层积处理过程中各阶段种胚生长发育情况，层积开始前处于心形胚阶段（图1A），层积20 d（图1B）时处于心形胚后期，至层积40 d（图1C）和60 d（图1D）时为鱼雷形阶段，层积80 d（图1E）和100 d（图1F）时为马蹄形胚阶段。图1A、1G-K为变温层积处理过程中各阶段种胚生长发育情况，层积20 d（图1G）时种胚发育处于鱼雷形过渡时期，层积40 d时（图1H）部分种胚发育为马蹄形胚阶段，层积60 d（图1I）和80 d（图1J）时种胚在继续生长，层积100 d（图1K）时种胚柄逐渐伸长，两片子叶清晰可见。

两种层积方式下，低温层积60 d时种胚才发育成鱼雷形（图1D），而变温层积在20 d时种胚即到此阶段（图1G）；低温层积80 d时种胚子叶伸长（图1E），到马蹄形胚阶段，而变温层积种胚在60 d子叶已清晰可见（图1I），胚柄逐渐生长；两种层积处理完成时种胚均已发育为马蹄形胚阶段，但低温层积直至100 d时两片子叶仍模糊（图1F），而变温层积100 d时两片子叶清晰可见（图1K），胚柄也逐渐伸长。说明变温层积有利于胚发育，有效终止老山芹种子休眠。

图1 不同层积处理过程中种胚形态的变化Fig.1Changes of embryo morphology during different temperature stratification process

2.3 不同层积条件下种胚主要形态指标动态变化

2.3.1 胚长

由图2可知，随着层积时间延长，两种层积方式胚长均逐步增加。在低温层积过程中种胚长度由未层积前0.46 mm增至0.66 mm，在变温层积过程中种胚长度由未层积前0.46 mm增至0.79 mm，表现极显著差异；两种层积处理，层积时间相同，变温层积条件下胚长生长更快；变温层积条件下胚长增加明显，每一取样时期相比低温层积均呈极显著差异；变温层积结束后胚长与每一取样时期相比均极显著增加。

2.3.2 胚宽

由图3可知，随着层积时间延长，两种层积方式胚宽逐步增加。在低温层积过程中胚宽由未层积前0.21 mm增至0.25 mm，在变温过程中种胚宽度由未层积前0.21 mm增至0.26 mm，极显著增加；变温层积条件下胚宽增加更快；除层积40 d外，其他取样时期变温层积较低温层积胚宽均呈极显著差异。

2.3.3 胚剖面面积

由图4可知，胚剖面面积与种子胚长及胚宽动态变化趋势一致，在低温层积过程中种胚剖面面积由未层积前0.086 mm2增至0.135 mm2，在变温过程中种胚剖面面积由未层积前0.086 mm2增至0.16 mm2，均极显著增加；变温层积条件下种胚剖面面积增加更快；每一取样时期变温层积较低温层积均呈极显著差异；变温层积结束后与每一取样时期相比均极显著增加。

图2 不同层积条件下胚长动态变化Fig.2Dynamics effects of different stratification condition on the embryo length

图3 不同层积条件下胚长动态变化Fig.3Dynamics effects of different stratification condition on the embryo width

图4 不同层积条件下胚剖面面积动态变化Fig.4Dynamics effects of different stratification condition on the embryo section area

2.3.4 胚附近胚乳的空腔面积

由图5可知，在低温层积和变温层积过程中，随着层积时间延长，胚剖面面积逐渐增加，而胚附近胚乳空腔面积递减，与胚剖面面积、胚长及胚宽动态变化相反；在低温层积过程中胚附近胚乳空腔面积由未层积前0.065 mm2降至0.024 mm2，变温层积过程中胚附近胚乳空腔面积由未层积前0.065 mm2降至0.014 mm2，均呈极显著下降；变温层积条件下胚乳空腔面积降低更快；每一取样时期变温层积较低温层积均呈极显著差异；变温层积结束后与每一取样时期相比均极显著下降。

图5 不同层积条件下胚附近胚乳空腔面积动态变化Fig.5Dynamics effects of different stratification condition on the embryo near endosperm area

2.3.5 胚率

胚率是判断种子是否完成形态后熟重要形态指标，当胚率接近100%时，外观上便停止发育。由图6可知，在低温层积过程中种胚胚率由未层积前10.5%增至13.7%，变温层积种胚胚率由未层积前10.5%增至14.8%，变温层积条件下种胚胚率增加更快；每一取样时期变温层积较低温层积均呈极显著差异；变温层积结束后与每一取样时期相比均极显著增加。

图6 不同层积条件下胚率动态变化Fig.6Dynamics effects of different stratification condition on the embryo rate

2.4 种胚主要形态指标增长率变化

2.4.1 胚长

由图7可知，不同时期两种层积处理胚长的增长速率表现各异。在低温层积过程中，层积20 d后胚长增长率为18.5%，20～40 d为1.5%，40～60 d为6.9%，60～80 d为5.8%，80～100 d为4.0%；在整个低温层积过程中胚长总增长率为41.0%。而在变温层积过程中，层积20d后胚长增长率为25.4%，20～40 d为6%，40～60 d为13%，60～80d为6.4%，80～100 d为5.1%；在整个变温层积过程中胚长总增长率为68.8%，较低温层积过程高27.8%；层积至20 d，20℃与层积40～60 d，零下20℃冷冻后转入4℃时，每一次取样时期呈极显著差异，变温层积每个时期胚长增长率与低温层积对比，均呈极显著差异。

图7 不同层积条件下胚长增长率动态变化Fig.7Dynamics effects of different condition stratifica⁃tion treatment on the growth rate of embryo's length

2.4.2 胚宽

由图8可知，不同时期两种层积处理胚宽增长速率表现各异。在低温层积过程中，层积20 d胚宽增长率为6.6%，20～40 d为4.3%，40～60 d仅为1%，60～80 d为4%，80～100 d胚宽增长率为4.96%。在整个低温层积过程中胚宽总增长率为22.3%。而在变温层积过程中，层积20 d胚宽增长率为8.9%，20～40 d为1.3%，40～60 d为7.86%，60～80 d为1.6%，80～100 d胚宽增长率为3.13%。在整个变温层积过程中胚宽总增长率为25.2%。较低温层积过程高2.9%；层积至20 d，20℃与层积40～60 d，零下20℃冷冻后转入4℃时，每一次取样时期呈极显著差异，变温层积每个时期胚宽增长率与低温层积对比，均呈极显著差异。

2.4.3 胚剖面面积

由图9可知，不同时期两种层积处理胚剖面面积增长速率表现各异。在低温层积过程中，层积20 d种胚剖面面积增长率为10.9%，20～40 d为 3.06%，40～60 d为12.9%，60～80 d为9.9%，80～100 d为11.7%。整个低温层积过程中胚剖面面积总增长率为57.7%。而在变温层积过程中，层积20 d种胚剖面面积增长率为21.16%，20～40 d为15.6%，40～60 d为16.6%，60～80 d为6.8%，80～100 d为5.3%。在整个变温层积过程中胚剖面面积总增长率为86.9%。较低温层积过程高29.2%；层积至20 d，20℃与层积40～60 d，零下20℃冷冻后转入4℃时，相比每一次取样时期呈极显著差异，变温层积每个时期胚剖面面积增长率与低温层积对比，均呈极显著差异。

图8 不同层积条件下胚宽增长率动态变化Fig.8Dynamics effects of different condition stratifica⁃tion treatment on the growth rate of embryo's width

图9 不同层积条件下胚剖面面积增长率动态变化Fig.9Dynamics effects of different stratification condition on the growth rate of embryo section area

2.4.4 胚附近胚乳的空腔面积

由图10可知，不同时期两种层积处理胚附近胚乳空腔面积增长速率表现各异。随着种胚生长，胚剖面面积不断填满胚附近胚乳空腔面积。在低温层积过程中，层积20 d胚附近胚乳空腔面积降低率为27.33%，20～40 d为13.06%，40～60 d为36%，60～80 d为12.4%，80～100 d为22%。低温层积过程中胚附近胚乳空腔面积总降低率为63%。而在变温层积过程中，层积20 d胚附近胚乳空腔面积降低率为41.3%，20～40 d为15.1%，40～60 d为73.8%，60～80 d为21%，80～100 d为35.3%。变温层积过程中胚附近胚乳空腔面积总降低率为80%。较低温层积过程降低17%；层积至20 d，20℃与层积40～60 d，零下20℃冷冻后转入4℃时，相比每一次取样时期呈极显著差异，变温层积每个时期胚附近胚乳空腔面积降低率与低温层积对比，均呈极显著差异。

图10 不同层积条件下胚附近胚乳空腔面积增长率动态变化Fig.10Dynamics effects of different stratification condition on the growth rate of embryo near endosperm cavity area

2.4.5 胚率

老山芹种子在低温层积过程中胚率增长率变化情况见图11。

图11 不同层积条件下胚率增长率动态变化Fig.11Dynamics effects of different stratification condition on the growth rate of embryo rate

由图11可知，层积20 d胚率增长率为1.6%，20～40 d为0.4%，40～60 d为0.5%，60～80 d为0.2%，80～100 d为0.5%。低温层积过程胚率总增长率为3.2%。而在变温层积，层积20 d胚率增长率为2.48%，20～40 d为0.5%，40～60 d为0.6%，60～80 d为0.26%，80～100 d为0.6%，变温层积过程中胚率总增长率为4.3%。较低温层积过程高0.9%；层积至20 d，20℃与层积40～60 d，零下20℃的冷冻后转入4℃时，相比每一次取样时期呈极显著差异，变温层积过程中每个时期胚率增长率与低温层积对比，均呈极显著差异。

3 讨论

3.1 老山芹种子休眠机制

种子休眠原因复杂，主要包括种皮障碍、后熟作用和抑制物质三个方面。非硬壳种子不存在种皮障碍问题，后熟作用和抑制物质为种子休眠主因。老山芹为种子繁殖，采收食用叶后植株进入种子繁殖阶段。确定其种胚分化情况，对老山芹栽培和种子繁育具有重要意义。本研究结果表明，老山芹种子休眠属于胚未分化完全类型，与人参[8]及刺五加[10]等植物研究结果相似。在层积过程中老山芹种子先后经历心形胚、心形胚后期、鱼雷形胚及马蹄形胚等阶段。与桂花等植物不同，老山芹种子采收时为心形胚，而桂花合子采收后经历棒形胚、球形胚、心形胚，至果实成熟时发育为鱼雷胚[15]。种子层积过程中种胚分化与生长，不同时期胚分化和发育速度不一致，与张鹏等研究东北刺人参种胚发育过程一致[11]。

3.2 低温与变温层积效果比较

层积处理为解除具有后熟特性种子休眠有效方法。种子在层积过程中完成一系列生理生化和种子后熟过程，降低或解除发芽抑制物质，增强水解和氧化酶活力，使种内复杂物质转化为可被种胚吸收和利用的小分子化合物，减弱对脱落酸敏感性[16]，最终解除休眠，具备萌发能力。

本研究结果表明，在两种层积处理过程中，老山芹种胚胚长、胚宽、胚面积以及胚率均随层积时间增加而不断增长，胚附近胚乳空腔面积随种胚逐渐增大而减少；两种层积方式中变温层积效果显著，利于胚发育，打破休眠。与张艳杰对南方红豆杉[17]及陈姗姗对山芹菜[18]研究观点种胚在低温层积条件下发育较好不一致，说明不同休眠特点植物种子层积处理方法不同。

暖温层积可显著加速胚生长发育，但无法终止种子休眠，须经低温处理，如百合、牡丹等植物种子需经过一段时间低温后才可萌发[19]；肉花卫矛种子在20～25℃层积45 d后再转入2～5℃层积45 d，种子发芽率显著升高；刺五加种子在常温（16～22℃）下层积处理无任何变化，而湿温/湿冷处理种子，在15～19℃下层积124 d，-1～5℃下层积71 d后，发芽率可达到80%[20]。

本研究根据老山芹种子秋季播种、经历秋-冬-春季自然变温环境后第二年出苗的生产实际，设计5段温度变温层积处理，即20℃/20 d→4℃/ 20 d→-20℃/5 d→4℃/30 d→20℃/25 d，效果良好。因涉及多种温度、处理时间及其排列组合，后续将开展深入研究，确定最佳变温层积处理方法，为老山芹产业化发展提供技术支撑。

4 结论

a.老山芹植株成熟采收种子时，种胚尚未分化完全，处于心形胚或鱼雷形胚阶段，需层积处理促进种胚发育。

b.两种层积处理种胚胚长、胚宽、胚剖面面积及胚率等指标均随层积时间推移而增加，胚附近胚乳空腔面积则随种胚逐渐增大而减小。

c.变温层积可加速老山芹种子后熟过程，缩短种子休眠时间。

[1]刘慎谔.东北植物检索表[M].北京:科学出版社,1959.

[2]于文海,王绍礼,李俊,等.大叶芹特性及丰产栽培技术[J].农业与技术,2007,2(1):122-124.

[3]刁绍起,朱楠楠,孙广仁,等.山芹菜营养成分分析与加工特性[J].东北林业大学学报,2010,38(10):48-50.

[4]陶丽霞.山芹菜的食用价值与栽培技术[J].中国林副特产,2001 (3):22.

[5]Niimi Y,Han D S,Abe S.Temperatures affecting embryo development and seed germination of Christmas rose(Helleborus niger) after sowing[J].Scientia Horticulturae,2006,107(3):292-296.

[6]杨国会,孙立梅,邢力,等.不同层积处理方法对东北红豆杉种子后熟过程中贮藏物质的影响[J].北方园艺,2013(14):82-85.

[7]安娜,崔秀明,黄璐琦,等.三七种子后熟期的生理生化动态研究Ⅱ.代谢物质含量变化分析[J].西南农业学报,2010,23(4): 1090-1093.

[8]李先恩,陈瑛,张军.人参胚后熟期间核酸、蛋白质、糖的变化及激素的影响[J].种子,1993(2):16-18.

[9]梁焕起,黄圣株,金基万,等.西洋参种胚形态后熟解剖观察[J].特产研究,1995(3):4-7.

[10]赵淑兰,沈育杰,杨义明.刺五加种子不同处理对胚后熟及出苗率的影响[J].特产研究,2005(4):24-26.

[11]张鹏,沈海龙,纪玉山,等.东北刺人参种胚形态后熟过程中的解剖观察[J].种子,2007(12):45-47.

[12]李富恒,刘增兵,崔巍金奇,等.老山芹生长发育规律及主要性状相关性分析[J].东北农业大学学报,2017,48(1):15-22.

[13]信小娟,刘成学,李玉成.大兴安岭山野菜老山芹栽培技术[J].防护林科技,2016(8):120-121.

[14]高阳,杨敏飞,苏娅萍,等.老山芹根中亲脂性化学成分的GCMS分析[J].西北药学杂志,2014,29(4):344-347.

[15]杨琴军,黄燕文,李和平.桂花胚和胚乳发育过程的研究[J].华中农业大学学报,2003(2):175-178.

[16]Junttila O.The mechanism of low temperature dormancy in mature seeds of Syringra species[J].Physiol Plant,1973,29:256-263.

[17]张艳杰.南方红豆杉种子休眠机理的研究[D].南京:南京林业大学,2007.

[18]陈姗姗.山芹菜种子休眠特性及萌发生理的研究[D].长春:吉林农业大学,2007.

[19]比尤利J D,布莱克M.种子萌发的生理生化,生活力.休眠与环境控制[M].南京:东南大学出版社,1990.

[20]章晓波,倪安丽,张文明,等.药用植物种子休眠的研究进展[J].中草药,1997,28(6):376-378.

Study onHeracleum moellendorffiiHance seed morphology after-ripening during different stratification condition

/LI Fuheng1,LI Nanding1,LIU Zengbing1,CUI Weijinqi1,БРЫКСИН Д.М.2,YU Ping1,XU Qinghua1(1.School of Life Sciences, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.The I.V.Michurin All-Russia Research Institute of Horticulture,Michurinsk 393774,Russin)

In this study the seeds ofHeracleum moellendorffiiHance were selected as trial material to discuss the effect of the morphological of seeds after ripening using low temperature and variety temperature stratification treatmented,which could reveal the seed dormancy mechanism and make it possible for other researchers to find the way of seed dormancy-breaking furtherly.The results showed that the embryo length,width,cross section area and rate increased over time under two stratification conditions,but on the contrary for the area of the cavity near the embryo was decreased. For the treatment efficiency,variety temperature stratification method was better.The paper convinced that variety temperature stratification method would accelerate the ripening process of theHeracleum moellendorffiiHance seed and shorten seed dormancy time.

Heracleum moellendorffiiHance;seed;stratification treatment;morphologic after-ripening

Q94

A

1005-9369（2017）05-0028-07

时间2017-5-23 12:28:45[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170523.1228.008.html

李富恒,李楠丁,刘增兵,等.不同层积条件下老山芹种子形态后熟的研究[J].东北农业大学学报,2017,48(5):28-34.

Li Fuheng,Li Nanding,Liu Zengbing,et al.Study onHeracleum moellendorffiiHance seed morphology after-ripening during different stratification condition[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(5):28-34.(in Chinese with English abstract)

2017-03-15

国家“十三五”重点研发项目（2016YFC0500307）；东北农业大学2017年大学生SIPT计划项目（201710224207）

李富恒（1962-），男，教授，博士生导师，研究方向为植物生理生化。E-mail:lifuheng1963@126.com