基于响应面法优化桑淮袋泡茶配方的研究

莫韩御，苏小军，2，3，李清明，郭时印，*

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128；2.湖南省作物种植创新与资源利用重点实验室，湖南长沙410128；3.湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南长沙410128）

基于响应面法优化桑淮袋泡茶配方的研究

莫韩御1，苏小军1，2，3，李清明1，郭时印1，*

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128；2.湖南省作物种植创新与资源利用重点实验室，湖南长沙410128；3.湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南长沙410128）

为了开发出一款功能型袋泡茶，采用单因素试验和响应面法优化袋泡茶配方：以干桑叶、干淮山片作为原料，经过打粉、过筛、装袋、冲泡后，以感官评定和体外降糖抑制率作为评价指标，分别探讨了桑叶产地、每包净重、桑叶粒度和桑淮质量比对桑淮袋泡茶的的影响；在感官评定优秀的基础上，再通过Box-Behnken响应面法优化分析每包净重、桑叶粒度和桑淮质量比对桑淮袋泡茶体外降糖抑制率的影响。结果表明：用广东产地的干桑叶，每包净重4.14 g，桑叶粒度为18目，桑淮质量比5∶1确定为桑淮袋泡茶的研制配方。

桑叶；袋泡茶；降糖；Box-Behnken响应面法

桑属桑科（Moraceae），是具有400多年历史的药食同源草本植物[1]。桑叶（Mori Folium）是植物桑Morus alba L.的干燥叶[2]，最常用做蚕的食物，也可用于民间用药[3]，用来民间治疗Ⅱ型糖尿病等相关的慢性病[4-8]。现代科学研究表明，桑叶富含生物碱类成分、黄酮类成分、多糖类成分、有机酸类成分、微量元素等[9]多种生物活性成分，具有降血脂[10]、降血糖[11]、降血压[12]、抗氧化[13]、抗炎[14]、抗动脉粥样硬化[15]、抗肿瘤[16]、抗惊厥[17]和血管扩张[18]的作用。

淮山又称山药，是传统药食两用植物，是薯蓣科（Dioscoreaceae）植物薯蓣（Dioscorea opposita Thunb）的块茎[19]。淮山其味甘性平，具有提高免疫功能、改善消化功能、促进降血糖血脂等功效，可用于治疗肺虚咳喘、脾虚久泻、糖尿病等症状[20]。

现代医学认为糖尿病是一种由于体内胰岛素分泌相对或绝对不足而引起的以糖代谢紊乱为主要特征的内分泌代谢性疾病[21]，其发病率不断增长，目前已成为发达国家中继心血管和肿瘤之后的第三大非传染性疾病，给社会和经济带来沉重负担[22]。为开发具有辅助降糖功效的天然食品，提高桑叶和淮山的使用价值，本试验对桑淮降糖袋泡茶的配方和工艺进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干桑叶、干淮山片：养天和大药房；α-葡萄糖苷酶：Sigma-Aldrich试剂公司；对-硝基苯酚99.5%（4-Nitrophenol，PNP）分析标准品、对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷 99%（4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）：阿拉丁；阿卡波糖（Acarbose）：德国拜耳；无水碳酸钠（分析纯）：天津博迪化工股份有限公司；磷酸盐缓冲溶液（pH=6.8）：厦门海标科技有限公司。

1.2 仪器与设备

可见光分光光度计（WFJ7200）：尤尼柯上海仪器公司；多功能粉碎机（750T）：铂欧五金厂；电热恒温水浴锅（DZKW-S-6）：北京市永光明医疗仪器厂；电子天平（BSA224S）：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Dragon Lab移液枪（100μL～1000μL；1000μL～5000 μL）：大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；冷冻离心机（5804R）：德国Eppendorf公司。

1.3 袋泡茶工艺流程

干桑叶、干淮山片→粉碎→过筛→调配装袋→包装→灭菌→成品→分析检测

1.4 方法

1.4.1 桑淮袋泡茶配方的优化

用规格为6 cm×8 cm的抽线玉米纤维茶袋，淮山产地为河南，以感官评定和体外降糖抑制率作为评判指标，根据预试验结果设置初始条件为桑叶产地为广东、每包净重为4 g、桑叶粒度为20目、桑淮质量比为6∶1，采取考察一个因素，固定其他因素的方法，考察各因素变化对感官评定和体外降糖抑制率的影响，平行3次。通过单因素试验的测定，在感官品质好的因素水平基础上，根据Box-Behnken设计原则，采取对体外降糖抑制率影响较为显著的因素，对配方进行响应面优化分析。

1.4.2 感官评定

参考GB/T 23776-2009《茶叶感官评审方法》[23]和GB/T 24690-2009《袋泡茶》制定标准[24]，并结合本产品特点，从袋泡茶的香气、滋味、色泽、料包四方面制定感官评定表，见表1。

表1 感官评定标准Table 1 Graded standard of sense quality

组织有食品专业背景或有感官评定经验的6人组成感官评定小组，每5种试样为一批，在进行品评时随机放置。每次只对一个指标评价，6人评分的平均值为样品的评价值。

1.4.3 降糖功效的测定

1.4.3.1 绘制PNP标准曲线

精确称取PNP标准品0.01 g，加超纯水定容至100 mL容量瓶中，摇匀即为母液。精确吸取母液1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL，分别置于25 mL具塞刻度管中加超纯水稀释至10 mL，得10个质量浓度梯度：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1 mg/mL，摇匀后静置10 min，每个梯度平行3次，于400 nm处测定分光光度计的吸光值。将10个梯度的数据进行整理，以标准品PNP浓度梯度为横坐标，吸光值为纵坐标，得到标准曲线y=21.182x+0.030 3，R2=0.999 6。

1.4.3.2 样品溶液的提取

将袋泡茶用150 mL、100℃热水冲泡5 min后，取20 mL茶汤于离心管，加入2 g活性炭，震荡混匀后4 000 r/min离心10 min，注射器吸取后用0.2 μm滤膜过滤，得到样品溶液。

1.4.3.3 α-葡萄糖苷酶体外降糖抑制实验

根据Li的方法[25]并通过预试验调整剂量，用0.3mL α-葡萄糖苷酶模拟人体小肠上端消化吸收糖分，以0.4 mL无色PNPG溶液作为底物，在37℃的水浴条件下反应可生成产物PNP，反应体系呈黄色。如果有抑制剂的加入，反应体系中生成产物PNP的量将会减少，黄色变浅。试验分为样品组、阳性对照组和空白组：样品组的抑制剂为0.1 mL的样品溶液，阳性对照组的抑制剂为0.1 mL的阿卡波糖溶液，空白对照组的抑制剂为0.1 mL的磷酸盐缓冲溶液（pH=6.8），37℃的水浴中反应30 min后，加入0.8 mL终止溶液Na2CO3溶液，震荡摇匀，加超纯水定容至5 mL，在400 nm分光光度计测定的吸光值。反应体系中各物质浓度分别为：α-葡萄糖苷酶为2 U/mL；PNPG为2 mg/mL；阿卡波糖为5 mg/mL；Na2CO3溶液为25 mg/mL。

抑制率/%=（X空白-X样品）/X空白×100

式中：X空白为空白组生成物PNP的平均质量浓度（mg/mL）；X样品为样品组生成物PNP的平均质量浓度（mg/mL）。

1.4.4 数据分析

实验数据以平均值±标准差（Mean±SD）表示。采用WPS Office 2016、Design-Expect V.8.0.6和SPSS工具进行处理，用Duncan多重比较法检测数据之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 桑叶产地对袋泡茶成品质量的影响

桑叶产地对袋泡茶成品质量的影响见图1。

图1 桑叶产地对袋泡茶成品质量的影响Fig.1 The effect of different place of origin of mulberry leaves on the quality of teabag

如图1所示，桑叶产地对袋泡茶品质有一定影响。广东产地的桑叶袋泡茶有桑叶的清香，茶色深浅适中有光泽，入口柔顺，料包均匀无破损，感官评分85.8分，抑制率63.60%，较其他产地更强；湖南产地的桑叶袋泡茶虽在香气上比安徽产地的更明显，色泽和滋味上得分不及安徽的高，总体感官评分低于安徽，同时抑制率也比安徽低；但与茶色平淡、口感无奇的河南和江苏产地的两种桑叶袋泡茶相比，湖南产地的感官评分和抑制率更好。

2.1.2 每包净重对袋泡茶成品质量的影响

每包净重对袋泡茶成品质量的影响见图2。

图2 每包净重对袋泡茶成品质量的影响Fig.2 The effect of different net weight of teabag on the quality of teabag

如图2所示，每包净重对袋泡茶品质有一定影响。随着每包净重的增加桑叶量也增加，桑叶清香更明显但袋泡茶的色泽和口感由淡转浓，抑制率越来越高，但从每包净重4 g到每包净重5 g时抑制率趋于平缓，就感官评价和产品成本出发，每包净重为4 g时袋泡茶就可以达到香气纯正，有桑叶淮山复合清香味，入口柔和，色泽均匀呈棕色透明且无沉淀，料包均匀无破损，感官评分84分，抑制率为62.99%，是较佳每包净重。

2.1.3 桑叶粒度对袋泡茶成品质量的影响

桑叶粒度对袋泡茶成品质量的影响见图3。

图3 桑淮粒度级对袋泡茶成品质量的影响Fig.3 The effect of different grain size of mulberry leaves on the quality of teabag

如图3所示，桑叶粒度对袋泡茶品质有一定影响。随着桑叶粒度变细（目数增加），袋泡茶色泽越浅、香气越淡、口感越平，抑制率越小，可能因为粒度越细粒度间的空隙越小而密，不利于与水接触；反之桑叶粒度的增加（目数减小），粒度间的空隙越大越松，虽然增加了与水的接触面，但是过多的接触面导致色泽太深影响感官评分，还增加了装袋的难度，综上分析桑叶粒度级为20目时，感官评分87.8分，抑制率为58.55%，是较佳桑叶粒度级。

2.1.4 桑淮质量比对袋泡茶成品质量的影响

桑淮质量比对袋泡茶成品质量的影响见图4。

图4 桑淮质量比对袋泡茶成品质量的影响Fig.4 The effect of different quality ratio of mulberry leaves and yam on the quality of teabag

如图4所示，桑淮质量比对袋泡茶品质有一定影响。随着桑叶比重的增加，袋泡茶的色泽加深，但对抑制率的提升由快到平缓。桑叶比重过小或不够时，袋泡茶的香气和滋味感官评分低。当桑淮质量比是6∶1时袋泡茶的感官品质得分最高为86.4分，其次是桑淮质量比为5∶1时感官评分为84.7分，但抑制率在5∶1时最佳，达到了71.52%，而抑制率在6∶1时为66.48%，综合考虑这两个水平的感官品质都在80分以上，最终选择5∶1作为较佳桑淮比。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面分析方案及试验结果

通过SPSS将上述单因素试验结果进行显著性分析，运用Design-Expect V8.0.6软件，选择每包净重、桑叶粒度级、桑淮质量比3个影响因子设计响应面试验，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理对各因素进行三水平试验设计，各因子编码值试验设计方案和试验结果见表2和表3。因为单因素试验中感官评分都在75.4分～87.8分，均达到良好的感官品质，所以将对α-葡萄糖苷酶的抑制率设为响应面试验的评判标准。

2.2.2 模型的建立及方差分析

运用Design-Expert 8.0.6软件对表3试验结果进行分析。分别对各因素进行多元线性回归和二次多项回归模型拟合。得到的数学模型为：

表3 Box-Behnken设计与试验结果Table 3 Box-Behnken design and test result

Y（抑制率）=71.45+4.16A-3.50B+0.33C-2.33AB-0.62AC-1.16BC-17.32A2-7.58B2-4.77C2

从方差分析及相关系数见表4。

表4 方差分析Table 4ANOVA

续表4 方差分析Continue table 4 ANOVA

可知，试验所选的二次多项式模型F=731.71，模型的P值<0.000 1，具有极显著性，说明模型有统计学意义；失拟项在P=0.05水平上影响不显著（P=0.127 5＞0.05），说明该模型无失拟，对模型有利，拟合程度良好可以很好地反映过程，具有实用价值；整个模型的决定系数R2=0.998 2，说明响应值的变化有99.82%来源于所选因素，模型的校正决定系数Adj R2=0.995 8，仅有总变异的0.42%不能用此模型来解释，进一步说明该模型拟合度好，能很好地描述试验结果；模型的相关系数Pred R2=0.976 2，说明预测值与实测值之间具有高度的相关性。回归模型中一次项A、B，交互项AB及二次项A2、B2、C2的P值均<0.01，达到级显著，交互项BC的P值小于0.05达到显著，而其余项显著性较差，说明各试验因素对响应值是非线性关系。通过对回归方程一次项系数绝对值大小比较，结合方差分析表中F值，可得到影响抑制率的主次顺序，在桑叶产地为广东的条件下，每包净重对袋泡茶体外降糖抑制率的影响最大，其次是桑叶粒度，最后为桑淮比，即：A>B>C。

2.2.3 交互作用分析及最佳配方的确定

响应面的曲面变化及等高线椭圆形状结合表4可以反映因素的交互作用。响应面坡度越陡峭，说明响应值对因素的改变越敏感，反之响应面的曲面坡度越平缓，说明响应值对因素的改变越迟钝，根据回归方程分析结果，作出综合效应随因素变化的响应面图，如图5～图7所示，反映了各显著影响因素交互作用对响应值的影响。

图5 每包净重和桑叶粒度级对袋泡茶体外降糖抑制率的影响Fig.5 Effect of net weight of teabag and grain size of mulberry leaves on in vitro hypoglycemic inhibition rate of teabag

图6 每包净重和桑淮质量比对袋泡茶体外降糖抑制率的影响Fig.6 Effect of net weight of teabag and quality ratio of mulberry leaves and yam on in vitro hypoglycemic inhibition rate of teabag

图7 桑叶粒度级和桑淮质量比对袋泡茶体外降糖抑制率的影响Fig.7 Effect of quality ratio of mulberry leaves and yam and grain size of mulberry leaves on in vitro hypoglycemic inhibition rate of teabag

由图5可知，每包净重和桑叶粒度的交互作用十分显著。抑制率随每包净重的增加和桑叶粒度变细呈现先升高后降低的趋势。由图6可知，每包净重和桑淮比的交互作用较不显著。抑制率随每包净重和桑淮质量比的增加均呈现先升高后降低的趋势。由图7可知，桑叶粒度和桑淮质量比的交互作用较显著。在桑叶粒度较粗的情况下，抑制率随桑淮质量比的增加趋势变化不太明显，随着桑叶粒度的变粗，抑制率的趋势为先缓慢升高后下降。

由Design-Expert 8.0.6分析软件的响应优化器对试验结果进行优化后，该模型预测最优解为每包净重4.14 g，桑叶粒度为17.44目，桑淮质量比为5.06∶1，在此条件下，抑制率的理论值为72.19%。根据实际操作的局限性，将袋泡茶的配方工艺条件修正为每包净重4.14 g，桑叶粒度18目，桑淮质量比5∶1。

2.2.4 验证试验

按优选的提取工艺进行3次验证试验，结果综合效应值分别为72.17%，71.57%，72.71%，与理论预测值基本吻合，说明该模型预测较好，得到的拟合方程可较好地描述因素与指标的关系，说明利用响应曲面法优化桑叶淮山袋泡茶配方工艺是可行的。

3 结论

以桑叶作为主要原料，淮山作为辅料，通过α-葡萄糖体外降糖抑制试验证明，桑淮袋泡茶具有一定降糖功效。通过人工品尝和体外降糖抑制试验筛选单因素最优条件，即桑叶产地：广东；桑叶粒度级：20目；桑淮总质量/包：4 g；桑淮质量比：5∶1。再采用了Box-Behnken响应面法进行拟合，充分考虑了各因素之间的相互作用，得到了明确的回归方程Y=71.45+4.16A-3.50B+0.33C-2.33AB-0.62AC-1.16BC-17.32A2-7.58B2-4.77C2，通过方差分析来预测结果，预测最佳结果为，在桑叶产地为广东的条件下，每包净重4.14 g，桑叶粒度17.44目，桑淮质量比5.06∶1，理论抑制率为72.193 4%。为提高试验的预测性和准确性，再经过验证试验表明该方法合理稳定，可利用此模型优化桑叶淮山袋泡茶的配方工艺，对具有降糖功效的袋泡茶和桑叶的开发利用有一定的指导意义。

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Optimization of Recipe of Mulberry and Yam Teabag by Response Surface Methodology

MO Han-yu1，SU Xiao-jun1，2，3，LI Qing-ming1，GUO Shi-yin1，*
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；2.Hunan Province Key Laboratory of Crop Cultivation and Resource Utilization，Changsha 410128，Hunan，China；3.Hunan Collaborative Innovation for Utilization of Botanical Function Ingredient，Changsha 410128，Hunan，China）

In order to develop a functional teabag tea，single factor experiments and response surface methodology were used to optimize the teabag recipe：the dry mulberry leaves and dried yam slices were used as raw materials.After the powder，sieving，bagging and brewing，sensory evaluation and in vitro hypoglycemic inhibition rate were used as evaluation indexes.The effects of mulberry leaf origin，net weight per pack，mulberry leaf grain size and mulberry and yam quality ratio on mulberry-yam tea were discussed respectively.Then，based onthe excellent method of sensory evaluation，the effects of net weight per bag，mulberry leaf size and mulberry quality on the hypoglycemia inhibition rate of mulberry-yam tea were analyzed by Box-Behnken response surface method.The results showed that the dry mulberry leaves in Guangdong were 4.14 g per bag，and the grain size of mulberry leaves was 18 mesh.The quality ratio of mulberry leaves and yam was 5∶1.

mulberry leaf；teabag；hypoglycemic；Box-Behnken response surface method

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.017

2017-03-27

湖南省科技计划项目（14B091）

莫韩御（1992—），女(汉)，硕士研究生，研究方向：营养与食品卫生学。

*通信作者：郭时印（1975—），男（汉），副教授，博士，研究方向：食品营养，功能食品。