响应面试验优化牛樟芝总三萜提取工艺

黄红雨，赵虎，金晓艳

（1.昌吉职业技术学院，新疆昌吉831100；2.昌吉州中医医院，新疆昌吉831100）

响应面试验优化牛樟芝总三萜提取工艺

黄红雨1，赵虎2，金晓艳1

（1.昌吉职业技术学院，新疆昌吉831100；2.昌吉州中医医院，新疆昌吉831100）

对牛樟芝总三萜提取工艺参数进行优化研究。采用单因素和响应面法优化最佳工艺条件。结果表明，牛樟芝总三萜提取最佳工艺参数为乙醇浓度78%、提取时间81 min、料液比1∶20（g/mL），在此条件下，牛樟芝总三萜得率为5.26%。方差分析表明，影响牛樟芝总三萜得率由大到小的因素为乙醇浓度＞提取时间＞料液比。研究结果表明响应面法可用来优化牛樟芝总三萜的提取工艺，通过牛樟芝总三萜的提取可为进一步开发药食同源类产品提供借鉴作用。

牛樟芝；总三萜；响应面；工艺优化

牛樟芝（Antrodia cinnamomea）又被称作牛樟菇，产于我国台湾，主要在牛樟树上，生长海拔较高[1-2]，是一种名贵药材，药用部分为子实体，形状不规则，具有大量的药用活性成分[3-4]，其中包括多糖、黄酮类化合物，三萜类化合物，核酸类物质，免疫蛋白等，有专家研究得出，多糖类化合物虽然含量很少[5]，但具有提高机体免疫力、抗肿瘤、抗血栓等功效，核酸类物质能够抑制血小板凝聚，预防和治疗动脉硬化等功效[6-7]。三萜类化合物能够起到抗氧化作用以及抑制癌细胞的繁殖，还具有降血压、降血糖等功效[8]，因此，牛樟芝总三萜类化合物具有重要的药用研究价值，提取牛樟芝总三萜成为目前急需解决的问题。本研究以牛樟芝为原料，利用单因素和响应面试验优化提取牛樟芝总三萜最佳工艺参数，为开发利用牛樟芝总三萜类药食同源产品提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验仪器与材料

BOEN型紫外-可见分光光度计：费尔伯恩精密仪器（上海）有限公司；ScienTZ-10N冷冻干燥机：临安汇发机械设备有限公司；熊果酸标品（批号100080-200306，质量分数≥98.5%）：北京华诺信得科技有限公司；牛樟芝：台湾亚芯生物科技有限公司；乙醇、高氯酸、5%香草醛-冰乙酸：临沂商城冠林化工产品有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 牛樟芝总三萜提取工艺流程

牛樟芝→清洗→沥水→烘干→破碎→超微粉碎→乙醇浸提→牛樟芝总三萜

1.2.2 牛樟芝总三萜提取单因素试验

1.2.2.1 乙醇浓度对牛樟芝总三萜得率的影响

在提取时间80 min、料液比1∶20（g/mL）的条件下，乙醇浓度分别为65%、70%、75%、80%、85%时，以牛樟芝总三萜得率为考核指标，考察乙醇浓度对牛樟芝总三萜得率的影响。

1.2.2.2 提取时间对牛樟芝总三萜得率的影响

在乙醇浓度75%、料液比1∶20（g/mL）的条件下，提取时间分别为70、75、80、85、90 min时，以牛樟芝总三萜得率为考核指标，考察提取时间对牛樟芝总三萜得率的影响。

1.2.2.3 料液比对牛樟芝总三萜得率的影响

在乙醇浓度75%、提取时间80 min的条件下，料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）时，以牛樟芝总三萜得率为考核指标，考察料液比对牛樟芝总三萜得率的影响。

1.2.3 牛樟芝总三萜提取工艺响应面试验

综合考察单因素试验结果，以乙醇浓度（A）、提取时间（B）、料液比（C）作为因素，以牛樟芝总三萜得率（Y）为考察值，设计三因素三水平的响应面试验，确定饮料最佳工艺参数。试验设计因素水平见表1。

表1 因素与水平Table1 Factors and levels

1.2.4 牛樟芝总三萜检测[9-10]

1.2.4.1 对照样的制备

准确量取熊果酸对照样10.00 mg，使用乙醇定容至100 mL，得到浓度为0.10 mg/mL的熊果酸对照样液，备用。

1.2.4.2 标准曲线的制作

准确取 0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL熊果酸对照样液，用水浴法将其干燥后，向其中加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，70℃水浴35 min，立即冰浴10 min，加入5.00 mL冰醋酸，摇匀，直到室温条件，同时做空白试验。采用紫外-可见分光光度计于548 nm处测定其吸光度（A）值，以熊果酸质量浓度（X）作为横坐标，以吸光度A值（Y）作为纵坐标，做出曲线，得标准曲线方程为Y=57.327 X+ 0.002 3，r=0.999 7，表明熊果酸在10 μg～120 μg线性关系良好。

1.2.4.3 待测样液的制备

准确称牛樟芝细粉末1 g，使用20 mL 90%乙醇溶液根据单因素试验规定进行浸提，过滤后，将滤液定容为250 mL。再精确量取1 mL于10 mL容量瓶中进行定容，测其吸光度，根据标准曲线即可得出牛樟芝总三萜得率。

1.3 数据分析

数据处理时，各个数据均采用平均数±标准差（x± s）的形式表示，并且通过SPSS 16.0数据分析软件进行分析处理[11]。

2 结果

2.1 牛樟芝总三萜提取单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对牛樟芝总三萜得率的影响

乙醇浓度对牛樟芝总三萜得率的影响见图1。

图1 乙醇浓度对牛樟芝总三萜得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the total triterpenoid yield of Antrodia cinnamomea

由图1可得，当乙醇浓度为65%时，牛樟芝总三萜得率最低，当乙醇浓度升高后，牛樟芝总三萜得率逐渐升高，当乙醇浓度达到75%时，牛樟芝总三萜得率最高，为4.52%。继续增大乙醇浓度后，牛樟芝总三萜得率几乎不变，因此选择乙醇浓度为70%、75%、80%为响应面研究水平。

2.1.2 提取时间对牛樟芝总三萜得率的影响

提取时间对牛樟芝总三萜得率的影响见图2。

图2 提取时间对牛樟芝总三萜得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on total triterpenoid yield of Antrodia cinnamomea

由图2可得，当提取时间为70 min时，牛樟芝总三萜得率最低，当延长提取时间后，牛樟芝总三萜得率升高，当提取时间为80 min时，牛樟芝总三萜得率最高，为4.50%。继续延长提取时间后，牛樟芝总三萜得率几乎不变，因此选择提取时间为75、80、85 min为响应面研究水平。

2.1.3 料液比对牛樟芝总三萜得率的影响

料液比对牛樟芝总三萜得率的影响见图3。

图3 料液比对牛樟芝总三萜得率的影响Fig.3 Effect of material/liquid ratio on total triterpenoid yield of Antrodia cinnamomea

由图3可知，当料液比为1∶10（g/mL）时，牛樟芝总三萜得率最低，随着溶剂的增多，牛樟芝总三萜得率先升高后降低，当料液比为1∶20（g/mL）时牛樟芝总三萜得率最高，随着溶剂的增多后，得率又逐渐下降，因此选择料液比为1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）为响应面研究水平。

2.2 牛樟芝总三萜提取工艺参数的优化

2.2.1 牛樟芝总三萜数学模型的建立与显著性检验

根据单因素试验结果，应用响应面软件进一步优化提取工艺参数。考察乙醇浓度（A）、提取时间（B）、料液比（C）对牛樟芝总三萜得率（Y）的影响，试验设计方案及结果见表2。

表2 Box-Benhnken的中心组合试验设计及结果Table 2 Box-Benhnken the central composite experimental design and results

采用Design-Expert8.0.6软件对表2数据进行多元回归拟合、方差分析及显著性检验，得到以牛樟芝总三萜得率为目标函数，关于各条件编码值的二次回归方程为：Y=4.89＋0.98A＋0.71B＋0.23C＋0.55AB＋0.065AC－0.37BC－1.48A2－1.17B2－0.78C2。对数据进行显著性检验，方差结果见表3，可信度分析结果见表4。

表3 回归方程方差分析表Table 3 Analysis of variance table for regression model

续表3 回归方程方差分析表Continue table 3 Analysis of variance table for regression model

表4 回归模型的可信度分析Table 4 Reliability analysis of the established regression model

由表3、4可知，此模型P值远小于0.01，能够得出此模型极显著，误差很小，故能够用此模型代替真实值对牛樟芝总三萜得率做出分析，R2=98.61%，试验值与理论值相关性高，此模型可靠性高。在回归模型中，一次项A、B，交互项AB，二次项A2、B2、C2，均极显著，一次项C，交互项BC，均显著。方差分析表明，影响牛樟芝总三萜得率由大到小的因素为乙醇浓度>提取时间>料液比。

2.2.2 因素间相互作用响应面分析结果

因素间相互作用响应面分析结果见图4。

图4 响应面及等高线图Fig.4 Response surfaces and contour plots.

响应面图能够反映出各个因素之间的相互关系以及相互作用程度[12-13]。通过响应面软件对数据进行分析，可得到图4。等高线能够更清晰直观反映两因素之间关系。椭圆形表示两因素之间影响极显著，圆形表示因素间影响不显著。乙醇浓度（A）与提取时间（B）为椭圆形，影响极显著，提取时间（B）与料液比（C）为椭圆形，影响显著，而乙醇浓度（A）与料液比（C）为圆形，影响不显著。

2.2.3 优化牛樟芝总三萜提取工艺参数

为确定最佳参数，对拟合的回归方程求分别一阶偏导数，并设其为0，得到三元一次方程如下：

求解得：A＝0.533、B＝0.200、C＝0，根据生产实际的水平，调整最佳参数为乙醇浓度为78%、提取时间为81 min、料液比为1∶20（g/mL），在此条件下，根据三次平行验证试验可得，牛樟芝总三萜得率为5.26%。

3 结论

以牛樟芝为原料，利用乙醇浸出法从其中提取牛樟芝总三萜类化合物。根据单因素和响应面试验得出，牛樟芝总三萜提取最佳工艺参数为乙醇浓度78%、提取时间81 min、料液比1∶20（g/mL），在此条件下，牛樟芝总三萜得率为5.26%。方差分析表明，影响牛樟芝总三萜得率由大到小的因素为乙醇浓度＞提取时间＞料液比。说明响应面法可用来优化牛樟芝总三萜的提取工艺，通过牛樟芝总三萜的提取可为牛樟芝总三萜提供参考，为进一步开发药食同源类产品提供借鉴作用。

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Response Surface Test Optimization of Extraction Process of Total Triterpenoids from Antrodia cinnamomea

HUANG Hong-yu1，ZHAO Hu2，JIN Xiao-yan1
（1.Changji Vocational and Technical College，Changji 831100，Xinjiang，China；2.Changji Chinese Medicine Hospital，Changji 831100，Xinjiang，China）

The extraction parameters of total triterpenoids from Antrodia cinnamomea were optimized.The optimum conditions were optimized by single factor and response surface method.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows：the concentration of ethanol was 78%，the extraction time was 81min，and the ratio of material to liquid was 1：20（g/mL）.Under this condition，the total triterpenes yield was 5.26%.The variance analysis showed that the factors influencing the yield of total triterpenes from Antrodia cinnamomea were ethanol concentration＞extraction time＞ratio of material to liquid.The results showed that the response surface method could be used to optimize the extraction process of triterpenoids from Antrodia cinnamomea，and the extraction of triterpenoids from Antrodia cinnamomea could provide a reference for the further development of medicinal and edible homologous products.

Antrodia cinnamomea；totaltriterpenes；response surface；process optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.008

2017-03-14

新疆维吾尔自治区高等学校科研项目（XJEDU2014S081）

黄红雨（1976—），女（汉），讲师，本科，研究方向：天然药物及中药开发。