链霉菌CPCC 202950大米发酵中1个新的苯甲酰胺类化合物

常珊珊+陈明华+王仁中+巫晔翔+董飚+余利岩+高增平+司书毅

[摘要] 采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、闪式反相C₁₈柱色譜以及反相HPLC等多种色谱技术和方法，从链霉菌CPCC 202950大米发酵产物中分离得到8个化合物，借助理化性质和波谱学数据分析，鉴定其结构为3-[（3′-氨基-3′-氧丙-1′-烯-2′-基）氧]苯甲酰胺（1），间位-羟基苯甲酰胺 （2），leptosphaepin （3），5-methyluracil （4），feruloylamide （5），对羟基苯乙酰胺 （6），vanillamide （7），环-（L-缬氨酸-L-丙氨酸）（8）。其中化合物1为1个新的苯甲酰胺类化合物，2为新的天然产物。化合物1～8对HIV-1蛋白酶均没有明显的抑制作用，对Hela，HepG2和U2OS 3株肿瘤细胞株也未显示出明显的毒性（IC₅₀>10 μmol·L^-1）。

[关键词] 链霉菌CPCC 202950；化学成分；大米发酵；HIV-1蛋白酶；苯甲酰胺

[Abstract] Eight compounds were isolated from the rice fermentation of Streptomyces sp. CPCC 202950 by a combination of various chromatographic techniques including column chromatography over silica，Sephadex LH-20，flash C₁₈，and reversed-phase HPLC. Their structures were identified as 3-[（3′-amino-3′-oxoprop-1′-en-2′-yl）oxy]benzamide （1），m-hydroxybenzamide （2），leptosphaepin （3），5-methyluracil （4），feruloylamide （5），p-hydroxyphenylacetoamide （6），vanillamide （7），cyclo （L-val-L-ala） （8）. Among them，1 was a new benzamide analogue，and 2 was a new natural product. In the preliminary assays，none of the compounds 1-8 exhibited obvious inhibition of HIV-1 protease activity，and toxic with the Hela，HepG2，and U2OS cells. （IC50 > 10 μmol·L^-1）.

[Key words] Streptomyces sp. CPCC 202950；chemical constituents；HIV-1 protease inhibitor；rice fermentation；benzamide

放线菌是微生物来源活性物质的重要资源之一，目前已知的微生物来源抗生素中，有2/3均是由放线菌产生的[1]。链霉菌属是放线菌中产生抗生素种类和数量最多的类群，广泛分布于土壤、海洋、极端环境及生物体内。临床上大家所熟知的抗生素如链霉素、红霉素、阿霉素、以及四环素等均来源于链霉菌[2-3]。因此，从链霉菌中寻找新的药物先导化合物一直是微生物药物学家关注的重点之一。

本课题组采用高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型对微生物发酵液提取样品库进行筛选，得到一株阳性链霉菌CPCC 202950。在前期研究中，本课题组已从该菌株液态发酵提取物中分离得到了12个化合物[4-5]，其中包括1个微量、新型具有较强HIV-1蛋白酶抑制活性的五肽类化合物。为进一步探寻该菌株中的次级代谢产物，本论文对该菌株的发酵条件进行了替换，采取大米固体发酵，以期获得更加丰富和新的抗HIV-1蛋白酶活性成分，并对发酵提取物的乙酸乙酯部位进行了分离纯化，得到8个化合物，利用波谱学技术分别鉴定为：3-[（3′-氨基-3′-氧丙-1′-烯-2′-基）氧]苯甲酰胺 （1），间位-羟基苯甲酰胺 （2），leptosphaepin （3），5-methyluracil （4），feruloylamide （5），对羟基苯乙酰胺 （6），vanillamide （7），环-（L-缬氨酸-L-丙氨酸）（8）。其中化合物1为1个新的苯甲酰胺类化合物，2为新的天然产物。

1 材料

1.1 仪器与试剂

1H和13C-NMR谱用Bruker 600 MHz核磁共振仪测定（溶剂峰为内标）；ESI-MS用Thermo LTQ XL线性离子阱质谱仪测定。闪式柱色谱使用利穗中压色谱仪（苏州利穗科学有限公司）。HPLC利用安捷伦1100型液相色谱仪（美国安捷伦公司）。Capcell AQ C₁₈色谱柱（日本资生堂公司）；薄层色谱硅胶（青岛海洋化工厂分厂）。

1.2 菌株

链霉菌CPCC 202950 （Streptomyces sp. CPCC 202950）由中国药学微生物菌种保藏中心提供，其16S rRNA基因序列经比对，其与链霉菌S.albospinus NBRC 13846的相似度为99.07%。

2 试验与结果

2.1 菌株发酵 将保藏的链霉菌CPCC 202950接种到YM斜面，28 ℃恒温箱培养1周，传代后同法复壮1次。将种子斜面挖块，碾碎接种于3个装有100 mL发酵培养基（葡萄糖0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，玉米浆0.4%，黄豆饼粉1%，淀粉2%，碳酸钙0.4%，二氯化钴0.000 4 mg·L^-1，调节pH 7.2，121 ℃，30 min灭菌）的500 mL锥形瓶中，28 ℃振摇培养48 h后，作为种子液。用无菌水将种子液稀释成1×10⁶⁰/mL的菌悬液。每个500 mL的三角瓶中放入80 g大米及120 mL蒸馏水，封口、浸泡过夜后在121 ℃，灭菌30 min，冷却后向每瓶加入10 mL上述菌悬液（共30瓶），并在28 ℃培养30 d。

2.2 分离与纯化 链霉菌CPCC 202950的大米发酵产物经95%乙醇超声提取40 min，提取3次，滤液经减压蒸去乙醇得到水混悬溶液，用乙酸乙酯萃取4次，得到水部位和乙酸乙酯部位。将乙酸乙酯部位（15.0 g）经硅胶柱色谱，依次用二氯甲烷-甲醇梯度（1∶0，50∶1，40∶1，30∶1，20∶1，15∶1，10∶1，5∶1，1∶1，0∶1）洗脱，经薄层色谱检测，合并相同流分，得到12个洗脱部位（A～L）。E部位（5.8 g）经硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷-甲醇梯度（1∶0，50∶1，35∶1，20∶1，10∶1，5∶1，0∶1） 洗脱，得到E1～E4。E3（4.2 g）经硅胶柱色谱，依次用二氯甲烷-甲醇梯度（1∶0，40∶1，25∶1，20∶1，15∶1，10∶1，1∶1，0∶1）洗脱，得到9个洗脱部位。E3-3经HPLC半制备（Capcell-Pak C₁₈，10 mm× 250 mm，5 μm，18% CH₃CN，1.5 mL·min^-1）得到5（2.8 mg）和7（3.2 mg）。E3-4经反相C₁₈闪式柱色谱分离，甲醇-水梯度（5%～100%，120 min）洗脱，得7个洗脱部位。E3-4-3经HPLC半制备（Capcell-Pak C₁₈，10 mm×250 mm，5 μm，14% CH₃CN，1.5 mL·min^-1）得到8（3.1 mg）。E3-6经Sephadex LH-20凝胶柱分离，甲醇等度洗脱，得5个洗脱部位。E3-6-5经HPLC半制备（Capcell-Pak C₁₈，10 mm×250 mm，5 μm，15% CH₃CN，1.5 mL·min^-1）得到2（3.8 mg），4（2.5 mg）和6（2.3 mg）。E4（2.8 g） 经硅胶柱色谱，依次用二氯甲烷-甲醇梯度（1∶0，40∶1，30∶1，20∶1，10∶1，5∶1，0∶1）洗脱，得到7个洗脱部位。E4-6经反相C₁₈闪式柱色谱分离，甲醇-水梯度（5%～60%，80 min；60%～100%，40 min）洗脱，得6个洗脱部位。E4-6-1经HPLC半制备（Capcell-Pak C₁₈，10 mm×250 mm，5 μm，3% CH₃CN，1.5 mL·min^-1）得到3（2.1 mg）。E4-6-3經HPLC半制备（Capcell-Pak C₁₈，10 mm×250 mm，5 μm，15% CH₃CN，1.5 mL·min^-1）得到1（3.3 mg）。

2.3 活性测定 荧光底物HIV-1蛋白酶模型测定化合物对HIV-1蛋白酶抑制活性见参考文献[5]，细胞毒活性测定见参考文献[6]。

3 结构鉴定

化合物1 白色无定型粉末，ESI-MS得到准分子离子峰 m/z 207 [M+H]+，HR-ESI-MS m/z 207.075 9 [M+H]+提示其分子组成为C₁₀H₁₀N₂O₃（计算值 C₁₀H₁₁N₂O₃，207.076 4），不饱和度为7。化合物1的1H-NMR谱显示1个间位二取代的苯环[δH 7.56（1H，dd，J=1.8，1.8 Hz，H-2），7.22（1H，dd，J=8.4，1.8 Hz，H-4），7.49（1H，dd，J=8.4，7.8 Hz，H-5），7.67（1H，d，J=7.8 Hz，H-6）]，1个末端双键[δH 5.48（1H，d，J=1.8 Hz，H-1′a），4.61（1H，d，J=1.8 Hz，H-1′b）]的质子共振信号；另外还有4个活泼质子[δH 7.43（1H，br s，NH-7a），8.01（1H，br s，NH-7b），7.50（1H，br s，NH-3′a），7.78（1H，d，J=br s，NH-3′b）]的共振信号。在13C-NMR谱和DEPT谱中，除了与上述基团相对应的碳信号之外，还有2个羰基共振信号[δC 163.1（C-3′），166.9（C-7）]。为了准确确定该化合物结构，进行了2D NMR实验。通过HSQC和1H-1H COSY谱解析，对该化合物NMR谱中1H以及相应的13C共振信号进行了准确归属（表1）。化合物1 的1H-1H COSY谱显示H-4/H-5/H-6邻位质子偶合的相关信号；HMBC谱中显示H-2与C-3、C-6、C-7，H-4与C-2、C-3、C-6，H-5与C-1、C-3、C-4、C-6，H-6与C-2、C-4、C-5、C-7，以及NH₂-7与C-1和C-7的HMBC信号，结合这些质子和碳共振信号的化学位移，推断化合物1中有1个3-氧取代的苯甲酰胺单元。同时，HMBC谱显示H₂-1′与C-2′和C-3′，NH₂-3″与C-2″和C-3″的相关信号，这些信号及其它们的化学位移，表明化合物1中含有1个2-氧取代的丙烯酰胺单元（图1）。结合该化合物的分子组成，上述的3-氧取代的苯甲酰胺和2-氧取代的丙烯酰胺这2个单元之间只能是通过1个氧原子相连，从而确定化合物1的结构为3-[（3′-氨基-3′-氧丙-1′-烯-2′-基）氧]苯甲酰胺{3-[（3′-amino-3′-oxoprop-1′-en-2′-yl）oxy]benzamide}。

化合物2 白色无定型粉末，ESI-MS m/z 138 [M+H]+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz） δ： 6.88（1H，dd，J=7.8，1.8 Hz，H-4），7.20（1H，dd，J=7.8，7.2 Hz，H-5），7.23（1H，dd，J=1.8，1.8 Hz，H-2），7.27（1H，dd，J=7.2，1.8 Hz，H-6）；13C-NMR （DMSO-d6，150 MHz） δ： 114.5（C-2），118.0（C-4），118.0（C-6），129.1（C-5），135.8（C-1），157.2（C-3），167.9（C-7）。上述数据与文献[7]对比，且经过二维核磁共振（2D-NMR）实验的确证，故鉴定化合物2为间位-羟基苯甲酰胺（m-hydroxybenzamide），该化合物为1个新的天然产物。

化合物3 白色无定型粉末，ESI-MS m/z 202 [M+H]+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz） δ： 10.02（1H，s，NH），7.43（1H，d，J=3.0 Hz，H-3），5.11（1H，dd，J=10.2，3.0 Hz，H-4），3.69（1H，m，H-5），3.45（1H，dd，J=11.4，5.4 Hz，H-6a），3.42（1H，dd，J=11.4，6.6 Hz，H-6b），2.05（1H，s，H₃-8）；13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz） δ： 23.0（C-8），62.6（C-6），71.4（C-5），81.5（C-4），126.5 （C-3），127.5（C-2），169.0（C-7），169.6（C-1）。上述数据与文献[8]对比，且经过二维核磁共振（2D-NMR）实验的确证，故鉴定化合物3为leptosphaepin。

化合物4 白色无定型粉末，ESI-MS m/z 127 [M+H]+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz） δ： 10.98（1H，s，NH-3），10.57（1H，s，NH-1），7.23（1H，d，J=5.4 Hz，H-6），1.71（3H，s，H-7）；13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz） δ： 164.9（C-4），151.5 （C-2），137.7（C-6），107.6（C-5），11.8（C-7）。上述数据与文献[9]对比，故鉴定化合物4为5-methyluracil。

化合物5 白色无定型粉末，ESI-MS m/z 194 [M+H]+。1H-NMR（acetone-d6，600 MHz） δ： 7.47（1H，d，J=15.6 Hz，H-7），7.20（1H，d，J=1.8 Hz，H-2），7.08（1H，dd，J=8.4，1.8 Hz，H-6），6.86（1H，d，J=8.4 Hz，H-5），6.59（1H，d，J=15.6 Hz，H-8），3.91（3H，s，4-OMe）；13C-NMR（acetone-d6，150 MHz） δ： 168.0（C-9），149.1（C-3），148.5 （C-4），141.4（C-7），128.1（C-1），122.7（C-6），116.0（C-5），111.3（C-2），56.2（C-3-OMe）。上述数据与文献[10]对比，故鉴定化合物5为feruloylamide。

化合物6 白色无定型粉末，ESI-MS m/z 152 [M+H]+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz） δ： 9.19（1H，br s，OH），7.32（1H，br s，NHa），7.02（2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6），6.76（1H，br s，NHb），6.66（2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5），3.21（2H，s，H-7）；13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz） δ： 172.8（C-8），155.8（C-4），129.9（C-2，6），126.6（C-1），114.9（C-3，5），41.4（C-7）。上述数据与文献[11]对比，故鉴定化合物6为对羟基苯乙酰胺。

化合物7 白色无定型粉末，ESI-MS m/z 168 [M+H]+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz） δ： 9.50（1H，br s），7.74（1H，br s，NHb），7.43（1H，d，J=1.8 Hz，H-2），7.35（1H，dd，J= 1.8，7.8 Hz，H-6），7.08（1H，br s，NHa），6.77（1H，d，J=7.8 Hz，H-5），3.79（3H，s，OMe）。上述数据与文献[5]对比，故鉴定化合物7为vanillamide。

化合物8 白色无定型粉末，ESI-MS m/z 171 [M+H]+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz） δ： 8.12（1H，br s，NH-1），7.99（1H，br s，NH-4），3.88（1H，m，H-6），3.68（1H，m，H-3），2.16（1H，m，H-7），1.28（3H，d，J=7.2 Hz，H-6），0.95（3H，d，J=7.2 Hz，H-8），0.84（3H，d，J=7.2 Hz，H-9）；13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz） δ： 168.7（C-5），166.6（C-2），59.3（C-3），49.6（C-6），31.0（C-7），20.0（C-10），18.5（C-8），16.8（C-9）。上述數据与文献[9]对比，故鉴定化合物8为环-（L-缬氨酸-L-丙氨酸）。

4 HIV-1蛋白酶活性抑制测试及细胞毒活性测试

当化合物1～8为10 μmol·L^-1时，在 HIV-1蛋白酶模型上没有显示出明显的抑制作用，以及对肿瘤细胞株HeLa，HepG2，U2OS均没有细胞毒作用，IC₅₀>10 μmol·L^-1。

5 小结与讨论

本文采用大米固体培养基对前期在液态发酵中产生新HIV-1蛋白酶抑制剂的菌株链霉菌CPCC 202950[4-5]进行了发酵，并从中分离鉴定了8个化合物，发现1个新的苯甲酰胺类化合物（1）以及1个新的天然产物（2）。比较大米和液态这2种不同培养条件下的次级代谢产物，发现除了化合物7（vanillamide），这2种培养基条件下的次级代谢产物并未重复产生。结合本课题组前期对链霉菌CPCC 203909也在这2种发酵条件下次级代谢产物的研究比较，发现链霉菌CPCC 203909在大米固体培养基条件下能产生更多新的曲古柳菌素类似物[6，12-16]。大米固体培养基一般在研究真菌的次级代谢产物中作为1种常规培养基使用，但是在研究链霉菌的化学成分时却很少作为发酵条件。而通过对2链霉菌株CPCC 203909和202950的研究，发现在大米培养基条件下也能产生比较丰富的次级代谢产物。因此，大米也可以被考虑作为一种能丰富链霉菌化学成分种类的固体培养基加以充分利用，期望能从其培养条件下的链霉菌中发现更多的活性天然产物，为新药创制提供更多的先导化合物。

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[责任编辑 丁广治]