濒危兰科药用植物DNA条形码鉴定

汤欢+向丽+李西文+孙伟+王美娜+黄云峰+叶萌

[摘要] 兰科药用植物形态分类困难，此研究采用DNA条形码分子鉴定法从分子水平验证兰科药用植物的传统形态分类。以matK，psbA-trnH和ITS2序列作为DNA条形码对已进行了形态鉴定的49属135种163份兰科药用植物样品进行分子鉴定，经DNA提取，PCR扩增、双向测序及校对拼接后，将得到的序列在GenBank中进行BLAST比对，然后运用MEGA 7.0软件中的Neighbor-joining （NJ）法构建物种系统进化树。结果表明，163份样品均能成功提取DNA；matK，psbA-trnH和ITS2序列的PCR扩增效率分别为100%，100%，98.77%；共获得487条序列，其中345条序列在GenBank数据库中比对到了相应物种的序列，142条为新增序列；运用NJ法构建的兰科药用植物系统进化树中，基于matK序列所构建的物种系统进化树要优于基于psbA-trnH和ITS2序列所构建的系统进化树。matK，psbA-trnH和ITS2序列在鉴定兰科药用植物过程中互为补充，DNA条形码分子鉴定法可用于辅助兰科药用植物的分类鉴定。

[关键词] 兰科；DNA条形码；药用植物；分子鉴定

[Abstract] In this study，DNA barcoding was used to validate the traditional morphological classification of medicinal plants of Orchidaceae. The 163 samples of 135 species belong to 49 genera which have been confirmed by morphological identification were collected. Candidate sequences，including matK，psbA-trnH and ITS2 sequences，were amplified，bidirectionally sequenced，and assembled. All the sequences were blasted to GenBank database at NCBI，then analyzed using Neighbor-joining tree method by MEGA 7.0. The results showed that the DNAs of 163 samples were successfully extracted. The amplification efficiency of matK，psbA-trnH and ITS2 sequences were 100%，100% and 98.77%，respectively. The 487 sequences were obtained，345 sequences of which have matched corresponding sequences in the GenBank database and 142 sequences were new sequences. The topology of NJ tree which were constructed with the matK sequences was better than the trees of psbA-trnH and ITS2 sequences. In conclusion，the matK，psbA-trnH and ITS2 sequences were complementary and suitable for identification of medicinal plants of Orchidaceae. DNA barcoding can be used as an auxiliary means for identification of medicinal plants of Orchidaceae.

[Key words] Orchidaceae；DNA barcoding；medicinal plants；molecular identification

兰科Orchidaceae是世界性大科之一，包括地生、附生、菌类寄生等生活方式[1]，在全世界约有800属20 000～35 000种[2-4]，Flora of China中记载中国境内的野生兰科植物共有194属（中国特有属11个） 1 388种（中国特有种491个）[4]。兰科植物中的许多物种因其形态高度进化，物种之间仅有极细微的差异，从形态上对其进行鉴定较困难。

自双名法确立以来的250多年里，人类共鉴定和描述了约170万种生物[5]，但这仅仅占到分类学家预计物种数量的15%[6]。DNA条形码（DNA barcoding）是一种基于DNA序列进行生物物种鉴定的技术，即利用标准化的一个或者几个DNA片段进行序列分析，根据核苷酸序列差异，对物种进行快速和准确的鉴定[7-9]。传统物种分类学主要依据物种形态和解剖特点进行鉴定，受鉴定人员的知识结构、经验以及物种生长发育状态等因素的影响[10]。DNA条形码分子鉴定法因是从分子水平对物种进行鉴定，突破了对经验的过度依赖，并且不受样品形态和取样部位的限制，鉴定稳定性和重复性高，操作簡单，便于缺少分类学知识的人员进行物种鉴定，能极大缓解当前分类人才短缺的现状。DNA条形码分子鉴定法通过构建系统进化树，可加速隐存种和新物种的发现。通过信息平台建立物种DNA条形码数据库，易于实现数字化，实现资源共享[11-15]。目前，DNA条形码分子鉴定法已在多种类型的药用植物鉴定中得到了广泛应用，表现出较强的鉴定能力[16-22]。

在悠久的中医药发展过程中，劳动人民很早就利用一些兰科植物进行治病，在中国现存最早的药学专著《神农本草经》中就以赤箭、石斛、白芨之名记载了3种兰科植物。传统中医认为许多兰科药用植物具有生津止渴、润肺化痰、清热解毒、活血调经、软坚散结、祛风止痛、止血、定惊、敛疮等功效。兰科药用植物的药用部位一般为其全草、块茎或假鳞茎，一些常用物种，如天麻、石斛、白及、山慈菇等，均具有较高药用价值？由于兰科药用植物形态分类较困难，很容易采集到形态相近的伪品而威胁到用药安全。因此，此研究运用DNA条形码分子鉴定法对兰科药用植物进行鉴定研究，筛选适合兰科药用植物分子鉴定的DNA条形码序列，探讨其在鉴定兰科药用植物上的可行性，从分子水平验证兰科药用植物的传统形态分类结果，保障用药安全。

1 材料

1.1 采集与鉴定

查阅中国数字植物标本馆（Chinese Virtual Herbarium，CVH，http：//www.cvh.org.cn/）和相关文献，并根据实际情况确定采样区域和采样路线。采样时，依据CVH中的标本信息，在兰科药用植物分布较集中的区域进行重点调查采集。采集地主要包括：广西壮族自治区百色市境内的那坡县老虎跳自然保护区和乐业-凤山世界地质公园以及广东省深圳市梧桐山脚下的“深圳市兰科植物保护研究中心”。共采集了49属135种163份兰科药用植物，经过“深圳市兰科植物保护研究中心”饶文辉馆长和广西中医药研究院黄云峰副研究员等兰科专家鉴定。

1.2 采样区域概况

那坡县老虎跳自然保护区位于广西西南部的百色市那坡县，与云南东南部、越南北部相邻。该区域地理坐标为东经105°31′—105°53′ E，北纬22°56′—23°15′ N，最高峰海拔1 603 m；多年平均日照1 404 h，年均温18.8 ℃，≥10 ℃的活动积温6 026 ℃，无霜期324 d；多年平均降水量1 408 mm，蒸发量1 388 mm；土壤主要为红壤、黄红壤、黄壤、石灰土等；气候温和、雨热充沛，植被保存较好，属北热带气候带，地带性植被型以沟谷雨林和石灰岩山地季雨林为主，是中越边境植物多样性核心区域，兰科植物尤为丰富。广西乐业-凤山世界地质公园位于云贵高原向广西盆地过渡的斜坡地带，由相邻的乐业大石围国家地质公园和凤山岩溶国家地质公园组成，该区域地理坐标为东经106°18′—107°06′ E，北纬24°18′—24°50′ N，海拔274～1 500 m，属亚热带气候，热量充沛，干湿季明显，每年5—10月为雨季，11月至次年4月为旱季；该区域土壤多为由砂页岩风化的残积母质发育而成的红壤、黄壤和低海拔的褐红壤，局部有石灰土。广东省深圳市梧桐山脚下的“深圳市兰科植物保护研究中心”保存着中国近千种原生兰科植物资源，被誉为“中国兰谷”，该中心所在区域属南亚热带气候。

2 方法

2.1 DNA提取、PCR扩增和测序

2.1.1 DNA提取 用75%乙醇擦拭经50 ℃低温干燥的叶片样品，称取约30 mg，经适当剪切后，将样品移入已灭菌的2 mL圆底EP管中，并向EP管中加入一颗小钢珠，再放入高通量组织研磨仪（Sceintz Biotech Co.，China）中，在50 Hz频率下研磨120 s后，加入核分离液（配方为：Tris-HCl （pH 8.0）终浓度100 mmol·L^-1，EDTA （pH 8.0）终浓度20 mmol·L^-1，NaCl终浓度0.7 mol·L^-1，PVP-40为2%，以上各物质配成溶液后灭菌，使用之前加入0.4%的β-巯基乙醇）[23]清洗1至多次（800 μL/次）至上清液无色后，用移液枪吸去上清液，留沉淀，再向其中加入裂解液，混匀后，使用56 ℃水浴过夜（8～12 h） （对于新鲜样品或较易提取出DNA的样品，可置于65 ℃水浴锅中水浴60～90 min），再采用植物基因组DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取兰科药用植物样品总基因组DNA。详细操作步骤参见中药材DNA条形码分子鉴定指导原则及试剂盒说明书。

2.1.2 PCR扩增和测序 通过查阅相关文献[24-31]，选择在兰科药用植物中使用较广泛的叶绿体基因组matK序列和psbA-trnH序列以及核基因组ITS2序列作为DNA条形码序列。扩增引物及PCR扩增程序详见相关文献[23]。采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增情况，对出现清晰目的条带的样品进行纯化后，运用ABI 3730XL测序仪（Applied Biosystems Co.，USA）进行双向测序。

2.2 数据处理

使用CodonCode Aligner V6.0.2 （CodonCode Co.，USA）软件对测序获得的序列进行质量分析和校对拼接，去除低質量区和引物区，获得了ITS2，psbA-trnH，matK这3种DNA条形码序列。再运用MEGA 7.0 （Molecular Evolutionary Genetics Analysis，USA）软件对候选条形码序列进行序列分析，用邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统进化树，并用自举检验法Bootstrap 1 000次检验各分支的支持率[32]。

3 结果与分析

3.1 DNA提取及PCR扩增

将163份兰科药用植物样品用核分离液洗后，加入裂解液，用56 ℃水浴过夜（8～12 h），以保证样品中的DNA能够充分溶出，提高DNA提取的成功率。之后，严格按照DNA提取试剂盒的操作步骤进行操作。163份兰科药用植物样品DNA均成功提取。PCR扩增后，样品经琼脂糖凝胶电泳检测（图1）。163条matK序列和psbA-trnH序列全扩增成功，ITS2序列扩增出161条（2条未出），扩增成功率98.77% （表1）。扩增成功的样品均有较明显的单一目的条带。经双向测序和校对拼接后，共得到487条DNA条形码序列。

3.2 BLAST分析

对得到的487条序列在GenBank数据库中运用BLAST方法进行序列比对。此研究获得的序列中，有345条在GenBank数据库中比对到了相应物种的序列，其中，在matK序列中有61条的BLAST比对率为100%，62条的BLAST比对率为99%，2条的BLAST比对率为98%，1条的BLAST比对率为97%；psbA-trnH序列中有23条的BLAST比对率为100%，46条的BLAST比对率为99%，21条的BLAST比对率小于99%；ITS2序列中有72条的BLAST比对率为100%，34条的BLAST比对率为99%，23条的BLAST比对率小于99%。另外，此研究中共有142条DNA条形码序列（分别为37条matK序列，73条psbA-trnH序列和32条ITS2序列）在GenBank数据库中比对不到相应的序列，这些DNA条形码序列作为新增条形码，将进一步完善数据库（表2）。

3.3 NJ树分析

采用Bootstrap 1 000次重复，仅显示自展支持率≥50%的数值。

将135种兰科药用植物的163条matK、163条psbA-trnH和161条ITS2序列分别运用NJ法构建系统进化树（图2）。matK，psbA-trnH，ITS2这3种序列的兰科药用植物NJ树中，各属物种均分别聚成一支，各物种的多条序列也分别聚成一支，3种序列相互补充，能够很好地将此研究中所做的兰科药用植物各物种区分开。其中matK序列构建的NJ树中各亚族能够很清晰地被分开，白及亚族与笋兰亚族及贝母兰亚族聚成一支，树兰族的香荚兰亚族没有和其他树兰族的物种聚成一支，柄唇兰亚族与毛兰亚族聚成一支，鸟巢兰族各亚族聚成一支，杓兰亚科各物种聚成一支。psbA-trnH序列构建的NJ树中各亚族能够很清晰地被分开，但杓兰亚科的物种没有聚成一支，毛兰亚族各属聚成了2支，鸟巢兰族各亚族聚成一支。ITS2序列构建的NJ树中各亚族能够很清晰地被分开，白及亚族与笋兰亚族及贝母兰亚族聚成一支，毛兰亚族与柄唇兰亚族各聚成一支，但树兰族的各亚族被分成了2部分，鸟巢兰族各亚族聚成一支，杓兰亚科各物种聚成一支。

4 结果与讨论

此研究选择在兰科植物中使用较广泛的matK，psbA-trnH，ITS2这3种条形码序列作为兰科药用植物分子鉴定的DNA条形码序列。此研究中163份兰科药用植物样品均在提取DNA前，使用核分离液进行了一至多次洗涤，以加大所提DNA的纯度和浓度。PCR反应体系为25 μL，当使用2.5 μmol·L^-1的引物各1 μL时扩增效果较好，而引物浓度过高时，比较容易出现非特异性扩增反应，容易产生引物二聚体，降低效率，而引物浓度过低时，会使扩增产物过少而影响后续实验。PCR循环的次数主要取决于起始模板DNA的浓度，由于循环反应的次数越多，反应中产生非特异性产物的量越大，因此，在满足产物得率的前提下，应尽量减少循环次数，此研究中设置的PCR循环次数为35～40次，所得到的PCR产量均能满足后续实验要求。

中国学者建立了以ITS2序列为主，psbA-trnH序列为辅的药用植物类中药材DNA条形码鉴定体系[33-35]。通过运用matK，ITS2和psbA-trnH这3种DNA条形码序列对135种163份兰科药用植物样品进行DNA条形码分子鉴定后发现matK序列较ITS2序列和psbA-trnH序列更适宜用于鉴定此研究中的兰科药用植物。Lahaye等[24]分析了以兰科为主的1 600份植物的DNA序列，发现单独使用matK序列的鉴定效率可达到90%以上。此研究的研究结果与Lahaye等的研究结果相符，这可能是由于

matK序列为叶绿体基因组序列，比较适宜鉴定兰科等单子叶植物，而ITS2为核基因组序列，在双子叶植物中有比较好的鉴定效率。由于兰科药用植物样品采集较困难，此研究所采集的兰科药用植物样品份数较少，上述发现还有待更深入的研究。由于所采集的每个物种仅有1～3份样品，这会导致对物种内变异的低估，或者没有分析姊妹类群而高估种间差异，使DNA条形码分析结果中的DNA条形码鉴定有效性和准确率偏高，在今后还应进一步扩大物种量和样品量，继续进行更深入的研究。

由于亚种、变种等种下等级以及某些属内物种，其DNA序列的差异较小，即使同时使用多段DNA条形码序列也很难对其进行有效鉴定，如在此研究中的石斛属样品，尽管同时运用了3种DNA条形码序列对其进行鉴定，仍然有一些物种不能分开。因此，很有必要在今后继续探索通用DNA条形码序列，并探索专门用于某些物种的特异DNA条形码序列，进一步改善相关的DNA提取方法和提取试剂，不断完善此分子鉴定法，逐步解决对种下居群鉴定困难等问题，并加速对兰科物种的大规模测序，完善兰科植物DNA条形码数据库，为今后更高效快捷地运用此DNA条形码分子鉴定法鉴定兰科植物提供参考序列，积极推进兰科植物鉴定和系统进化研究。

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[责任编辑 吕冬梅]