两种接种途径对羊布鲁菌病疫苗免疫抗体变化的影响

2017-06-21郑文金闫海滨林怀明杨国丽何利昆曹明慧

中国兽医杂志 2017年5期

张雷，曹东，郑文金，闫海滨，林怀明，杨国丽，何利昆，陈瑶，曹明慧

(1.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164 ； 2.辽宁省动物医学研究院，辽宁沈阳110164 ；3.辽宁省建昌县动物疫病预防控制中心，辽宁葫芦岛125300 ； 4.中国兽医药品监察所，北京海淀100081)

张雷1，2，曹东1，2，郑文金3，闫海滨1，2，林怀明3，杨国丽1，2，何利昆1，2，陈瑶1，2，曹明慧4

动物布鲁菌病是一种严重影响牛、羊养殖业的人兽共患传染病，给畜牧业生产和人类健康带来了巨大的危害。在疫情比较严重的地区，通过给易感动物接种布鲁菌病疫苗，是目前防控动物发生布鲁菌病的主要措施之一。在疫苗厂家提供的布鲁菌病疫苗使用说明书中，规定可以通过口服或肌肉注射等方法进行免疫，但是这两种免疫方法在实际的疫苗免疫中的免疫效果以及差异并没有提到。本试验通过口服和肌肉注射两种接种途径对羊进行布鲁菌病S2疫苗的免疫，然后对免疫抗体产生情况进行了比较分析。

1 材料

1.1 疫苗 S2布鲁菌病疫苗(批号：2016005)，新疆天康畜牧生物技术有限公司生产。

1.2 实验动物分别选择1个绵羊规模场(A场)和1个山羊场(B场)，要求选择的规模场2年内布病抗体检测阴性或病原学无阳性，且防疫条件良好，能够与外界形成有效的防疫隔离。

1.3 免疫工具改良的连续注射器，可更换针头和喷注喷头。

1.4 试剂虎红平板凝集抗原(201602)、试管凝集抗原(批号：201601)，均购自中国疾病预防控制中心。

1.5 分析软件 SPSS 17.0统计分析软件。

2 方法

2.1 羊场的布鲁菌病净化对选择的羊场的全部羊只连续进行2次布鲁菌病的净化，两次净化间隔1个月，以避免本底血清和群体发生布鲁菌病对试验结果的影响。

2.2 羊群的分组绵羊规模场(A场)随机选择羊34只(2月龄以上)，随机分为2个组，分别为口服免疫组22只(A1组，免疫20只，空白对照2只)、肌肉注射免疫组12只(A2组，免疫10只，空白对照2只)。山羊规模场(B场)随机选择羊46只(2月龄以上)，随机分为2个组，分别为口服免疫组23只(B1组，免疫20只，空白对照3只)、肌肉注射免疫组23只(B2组，免疫20只，空白对照3只)。羊群分组后，每组的羊只单独饲养在一个圈舍内，不得与其他羊群混养。

2.3 免疫方法

2.3.1 口服疫苗组按照疫苗说明书的方法进行免疫。将冻干疫苗用生理盐水稀释后，进行口腔喷注，每只羊免疫1头份。免疫操作时，用改良的连续注射器将疫苗注入口内，然后捏紧嘴巴，待其将疫苗咽入后，再松开嘴巴。

2.3.2 肌肉注射疫苗组按照疫苗说明书的方法进行免疫。将冻干疫苗用生理盐水稀释后，用连续注射器注入颈部肌肉，每只羊免疫1头份。免疫过程中每只羊使用1个针头，避免交叉污染。

2.3.3 血清采集时间分别在免疫后3、7、9、15、35、70、97、121、166、185日龄进行采血检测，后续血清采集时间依据抗体水平检测结果再决定。

2.3.4 抗体检测方法按照国家标准GB/T18646—2002中虎红平板凝集方法和试管凝集方法操作，先用虎红平板凝集试验进行初筛，初筛阳性的血清再用试管凝集试验进行下一步的抗体检测。

2.3.5 抗体滴度检测方法按照国家标准GB/T18646—2002中试管凝集方法操作，将检测的血清倍比稀释，稀释的滴度分别为1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400。

2.4 免疫效果分析将试验结果统计后，利用统计软件SPSS17.0 比较分析两种免疫途径对动物布鲁菌病群体免疫抗体的差异。

3 结果

3.1 羊场布鲁菌病净化结果两个养殖场的两次净化的布鲁菌病抗体检测结果全部为阴性，可以进行下一步的试验。

3.2 群体免疫抗体产生分析结果

3.2.1 群体抗体阳性率产生情况试验羊只在免疫后按照计划的时间进行血清采集检测，并对免疫群体的抗体阳性率情况进行分析。两种免疫途径的群体抗体阳性率产生情况见表1，并将抗体阳性率产生情况绘制成图，见图1。

表1 两种免疫途径的群体抗体阳性率产生情况

图1 两种免疫途径的群体抗体阳性率产生情况

3.2.2 两种免疫途径对群体免疫抗体滴度的影响

(1)抗体滴度汇总：对口服免疫和肌肉注射免疫产生的抗体滴度进行汇总分析。由于第1天、第3天、第185天抗体滴度全部为0,就不再进行统计分析，只进行第5天、9天、15天、35天、70天、97天、121天、166天共8批次的汇总分析，汇总结果见表2，并绘制抗体滴度分布百分比图(中插彩版图2)，其中抗体滴度<1∶25用白色部分显示，抗体滴度>1∶25的滴度都用彩色显示，颜色随着滴度的增加而逐渐加深；(2) 平均抗体滴度变化情况：在统计分析之前，需要将抗体滴度表示方式转化为对数方式和编码滴度(见表3)，然后计算群体平均抗体编码滴度[1](见表4)，并绘制群体平均抗体编码滴度曲线图(见图3)；(3) 差异性检验：利用SPSS 17.0统计分析软件对两种免疫途径产生的抗体进行t检验，并将t检验值进行汇总(见表5)。

表2 免疫后不同日期抗体滴度汇总表

表3 抗体滴度转化成编码滴度方式

*：<1∶25按照1∶12.5计算；**：T/C =滴度倒数/C最初稀释度

4 讨论

动物布鲁菌病是近些年来威胁养殖业以及人类健康的一个重要的人兽共患传染病，采取布鲁菌病疫苗免疫是防控该病的一个有效的措施。在疫苗厂家提供的疫苗使用说明书中，推荐动物布鲁菌病的免疫方法为口服免疫或肌肉注射，但是对于这两种免疫方法的免疫效果的差别以及产生的抗体持续情况、抗体滴度的消长情况等未做具体说明，而且目前国内外也未见相关报道。

表4 免疫后不同日期的群体平均编码滴度情况

图3 免疫后不同日期群体平均抗体编码滴度变化

表5 两种途径免疫后不同天数的抗体滴度t检验比较结果

a：差异极显著； b：差异显著

本试验主要采用了口服和肌肉注射两种方式进行免疫，并在免疫后的不同日期检测免疫抗体。在免疫抗体评估的指标上，主要选择了群体免疫的评估方法。所谓群体免疫，就是当传染病的病原体传入某一动物群体时，动物群体的大部分个体因接种疫苗而获得了免疫力，使其他没有免疫力的个体间接受到保护而免于感染。在预防接种的群体免疫效果评估指标中，常用的评估指标有抗体转阳率、保护率、效果指数、保护指数、抗体平均滴度和抗体持续时间等[2]。其中效果指数是指对照组的发病率/接种组的发病率，一般大于1，保护指数是指(对照组发病率-接种组发病率)/对照组发病率，但是对于本试验来说，由于无法进行暴露试验或攻毒试验，因此保护率、效果指数、保护指数都不适合动物布鲁菌病的疫苗评估，只选择了抗体转阳率、抗体平均滴度和抗体持续时间等指标，并对这些指标进行了统计分析。

在抗体转阳判定的滴度值方面，由于在动物布鲁菌病免疫效果评价过程中目前还没有相关规定，而在GB/T18646—2002中，规定血清感染抗体在1∶50 稀释时出现50%凝集的动物即可判定为阳性，因此在本试验中暂时将1∶50的滴度凝集做为判定标准，可能在转阳率的判定过程中稍有误差，但不影响抗体滴度曲线变化及差异显著性的统计分析。

在试验动物的选择上，同时选择了绵羊和山羊，以避免在试验结果的分析中受到畜种差别的影响。在每个试验组中，都设置了哨兵动物做为空白对照。在整个试验过程中，空白对照都未检出抗体，表明在整个试验过程中试验结果未受到外来布鲁菌病的影响。

从本试验的结果来看，口服免疫产生的效果明显比肌肉注射的效果差。

在抗体产生时间上，口服免疫在免疫后第9天才检测到抗体，而肌肉注射免疫在第5天即可检测到；在群体抗体转阳率上，肌肉注射的群体转阳率迅速上升，在第5天时，平均抗体阳性率就达到70%，峰值出现在第15天，群体转阳率达到96.7%，持续时间长，一直持续到第166天仍可检测到抗体，而口服免疫虽然峰值出现的时间也在第15天，但是群体抗体转阳率仅为25%，检测到抗体的时间持续到第121天，在第166天以后就没有检测出抗体。

在抗体滴度的检测上看，肌肉注射的抗体滴度也明显超过口服免疫，口服免疫产生的最高平均编码滴度出现在第15天，仅为0.75，而肌肉注射产生的平均编码滴度最高为4.3，而且在第5天到第97天期间产生的平均编码滴度都超过口服免疫产生的最高平均编码滴度。将两者的抗体滴度产生情况进行t检验，发现从第5天开始，一直到第166天为止，两者的差异都在显著以上，在第5天到第97天期间，两者的差异为极显著。

分析口服免疫途径产生的抗体效果差的原因，可能是在接种过程当中，疫苗受到消化道中各种消化液成分的影响。

动物机体防御布鲁菌病的过程既是体液免疫的过程，也是细胞免疫的过程。在评估动物免疫效果的评价指标中，除了血清抗体指标以外，还需要进行细胞免疫方面的评估，包括IFN、IL、免疫细胞变化等，将两者综合分析，才能完全揭示出机体的整体免疫情况。本研究从免疫抗体变化规律方面反映了动物布鲁菌病疫苗免疫后的效果，为动物布鲁菌病的防控提供了参考数据。

[1] 黄保续.兽医流行病学[M].北京：中国农业出版社，2009:248-253.

[2] 何启盖.群体免疫、群体健康与猪病防控[J].养殖与饲料，2015(1)：1-4.

2016-12-31

张雷(1976-)，男，高级兽医师，硕士，从事动物疫病检测和研究工作，E-mail: leizhang266@163.com

S851.35

0529-6005(2017)05-0052-03