猪繁殖与呼吸综合征病毒乌鲁木齐分离株GP5基因遗传变异分析

2017-06-21蔡扩军李爱巧杨启元韩义忠陈发喜梁望旺

中国兽医杂志 2017年5期

蔡扩军，李爱巧，何生，杨启元，韩义忠，陈发喜，梁望旺

(1. 乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心，新疆乌鲁木齐830063 ； 2. 乌鲁木齐市米东区畜牧兽医站，新疆乌鲁木齐831400 ； 3.乌鲁木齐市米东区三道坝畜牧兽医站，新疆乌鲁木齐831403 ；4. 重庆市动物疫病预防控制中心，重庆渝北401102)

蔡扩军1，李爱巧1，何生2，杨启元1，韩义忠3，陈发喜1，梁望旺4

为对乌鲁木齐市猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子遗传变异情况进行研究与分析，应用RT-PCR方法对疑似感染PRRSV猪的组织脏器进行PRRSV GP5基因的扩增，将阳性样品PCR产物进行克隆和测序，并应用分子生物学软件对测序结果进行比对和遗传进化分析。结果显示,5株病毒分离株GP5基因全长均为603 bp，与JXA1株亲缘关系较近，同属于美洲株的同一基因亚群。本试验结果为掌握乌鲁木齐市PRRSV的分子遗传变异情况提供了依据。

猪繁殖与呼吸综合征病毒； GP5基因；遗传变异

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，是由猪繁殖PRRSV引起的一种高度接触性急性传染病。主要引起怀孕母猪的繁殖障碍以及仔猪的呼吸系统疾病，对幼龄仔猪具有较强的致病性和较高的病死率。该病自1987年首次在美国发现，其后在世界各主要养猪国家广泛流行，目前该病已成为危害养猪业发展的主要病毒性疾病之一[3]。

PRRSV易发生变异，其中GP5是变异最大的结构蛋白[1-2]。因此，GP5基因的变异情况在一定程度上反应了PRRSV整个基因组序列的变异情况。本文通过对乌鲁木齐市PRRSV流行毒株的ORF5基因序列进行测序，并跟国内外代表毒株进行比对分析，以期为该地区PRRS防制提供必要的分子流行病学信息。

1 材料与方法

1.1 病料样品疑似感染PRRSV猪的肺、淋巴结、扁桃体等组织病料。

1.2 主要试剂病毒核酸纯化试剂盒、RT-PCR一步法试剂盒，购自TaKaRa公司。

1.3 引物设计上游引物：5'-CCCGTTGGAATGGTACTCCTCAACTG-3'；下游引物：5'-CGGGGTCTGAT TGCTGGTAATCAGAAT-3'。预计扩增目的片段大小773 bp。

1.4 GP5基因的扩增与测序参照病毒核酸纯化试剂盒说明书对PRRSV阳性组织样品的总RNA进行提取。按照RT-PCR一步法试剂盒对提取的RNA进行RT-PCR扩增，将PCR阳性产物进行测序。

1.5 基因序列遗传进化分析应用GenBank Blast和DNAStar生物学分析软件对扩增的核苷酸序列进行分析，并与GenBank中登录的PRRSV GP5基因序列和推导的氨基酸序列进行同源性比较，利用和Mega6.0软件绘制系统进化树。

2 结果

2.1 目的基因的扩增结果用RT-PCR法从9份疑似感染PRRSV的样品中扩增出5份与预期片段大小相符的特异性片段，扩增结果见图1。

图1 分离毒株ORF5 基因的扩增

M：DL-1 000 DNA Marker； 1-3，9：扩增阴性； 4-8：扩增阳性； 10：阳性对照； 11阴性对照

2.2 目的基因的序列测定结果送去测序的5株GP5基因全长均为603 bp，编码201个氨基酸，登录NCBI 利用Blast对测序结果进行分析，结果表明，扩增得到的5条序列为PRRSV 0RF5基因序列，命名为WLMQ-1-5株。

2.3 PRRSV GP5基因核苷酸与氨基酸序列同源性对比分析将本试验从阳性样品扩增出的5株PRRSV GP5基因与GenBank上国内外已发表的15株PRRSV GP5基因序列进行同源性分析比较，比对结果见图2和图3。

图2 分离株ORF5 基因核苷酸同源性比较

图3 分离株ORF5 基因编码氨基酸同源性比较

2.4 PRRSV ORF5序列遗传进化关系将乌鲁木齐市5株PRRSV GP5基因序列与GenBank上国内外已登录的15株PRRSV GP5基因构建遗传进化树(图4)，结果显示，本试验测序鉴定的病毒分离株与欧洲株LV亲缘关系最远，与经典PRRSV毒株BJ-4株、VR2332株亲缘关系较远，与以PRRSV JXA1株为代表的国内其他几株分离毒株在同一个分支上，说明亲缘关系最近，属于美洲株(Type 2)同一亚群。说明所分离的毒株可能由国内流行毒株进化而来。

图4 PRRSV ORF5序列遗传进化关系

3 讨论

PRRSV属于有囊膜RNA病毒，归属套式病毒目(Nidovirales)，动脉炎病毒科(Arteriviridae)，动脉炎病毒属(Arterivirus)，基因组约为15 kb，包括ORFla、ORFlb、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a、ORF5、ORF6和ORF710个开放性阅读框(ORF)[3-5]。由ORF5编码的GP5糖蛋白是该病毒主要的免疫原性结构蛋白之一，具有良好的抗原性，在病毒吸附和进入宿主细胞过程中发挥作用，能引起机体产生具有保护作用的有效免疫应答。该糖蛋白内含一段中和病毒的区域和作为病毒最保守区前导序列的2个糖基化位点，对受体具有识别作用，同时具有诱导细胞凋亡的功能。PRRSV的GP5研究表明，猪感染PRRSV后，ORF5基因的多个位点在病毒增殖过程中具有较高的变异率，是目前PRRSV的遗传变异分析和基因进化树的构建主要依据[6-8]。PRRSV同其他有囊膜的RNA病毒一样，自然选择压力导致基因组变异率极高，造成疫苗免疫失败，从而造成疫病的反复流行。因此预防该病的主要方法之一就是选择当地流行毒株作为疫苗背景进行免疫。

本试验乌鲁木齐5个分离株与美洲型JXA1遗传关系较近，可归属同一基因亚群，这有利于乌鲁木齐市PRRS 的净化。理论上以美洲型JXA1株或HPRRSV毒株制成的弱毒疫苗和灭活苗，其免疫保护力应高于RespPRRS MLV 疫苗和CH-1a 灭活苗。但相比灭活苗，弱毒苗能够刺激机体产生更高的中和抗体，从而提供更好的保护[9]，但要注意弱毒疫苗的回复突变导致毒力返强[10]。同时，本试验也在一定程度上反应了PRRSV的同源性与其在空间上的分布或时间上的差异存在较强的对应关系。

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Genetic variation and phylogenetic analysis of glycoprotein 5 gene of pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus inUrumqi

CAI Kuo-jun1, LI Ai-qiao1, HE Sheng2, YANG Qi-yuan1, HAN Yi-zhong3, CHEN Fa-xi1, LIANG Wang-wang4

(1.Urumqi Animal Disease Control and Diagnosis Center, Urumqi 830063, China; 2. Animal Husbandry and Veterinary Station of Midong District of Urumqi, Urumqi 831400, China; 3.Animal Husbandry and Veterinary Station of Sandao ba District of Urumqi，Urumqi 831403，China；4. Chongqing Animal Disease Prevention and Control Centre, Chongqing 401102, China)

To study and analyze the molecular genetic variations of pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) in Urumqi, the GP5 genes of suspected PRRSV positive samples were amplified by RT-PCR.PCR products of positive samples were cloned and sequenced．The results of alignment analysis showed that all the full length of GP5 from 5 isolates was 603bp, and they were closely related to the JXA1strain and belonged to the same subgroup. This study would provide the basis for mastering the molecular genetic variation of PRRSV in Urumqi．

porcine reproductive and respiratory syndrome virus; GP5 gene; variation and phylogenetic

LI Ai-qiao

2016-07-07

新疆维吾尔自治区科技厅科技援疆项目(201491165)；乌鲁木齐市科技局应用开发研究计划(Y141210013)

蔡扩军(1985-)，男，兽医师，硕士，主要从事动物疫病诊疗工作，E-mail：caikuojun@163.com

李爱巧，E-mail：laq4616369@126.com

S852.65

0529-6005(2017)05-0020-03