禽腺病毒4型鞭毛重组蛋白的原核表达及其免疫效果研究

刘 超 ， 侯 磊 ， 韦 莉 ， 王 菁 ， 全 荣 ， 朱珊珊 ，李子璇 ， 齐宾宾 ， 王利佳 ， 姜海军 ， 王 丹 ， 刘 爵

(1.北京农学院动物科技学院 ， 北京昌平102206 ； 2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所 ， 北京海淀100097)

禽腺病毒4型鞭毛重组蛋白的原核表达及其免疫效果研究

刘 超1，2， 侯 磊2， 韦 莉2， 王 菁2， 全 荣2， 朱珊珊2，李子璇2， 齐宾宾2， 王利佳1，2， 姜海军2， 王 丹2， 刘 爵2

(1.北京农学院动物科技学院 ， 北京昌平102206 ； 2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所 ， 北京海淀100097)

为研究禽腺病毒4型重组鞭毛-fiber2蛋白免疫保护性，将鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因与禽腺病毒4型的fiber2基因融合，再将融合基因和单独的fiber2基因分别克隆到原核表达载体pET-28a，后将构建的pET-28a-flagellin-fiber2和pET-28a-fiber2重组载体分别转入大肠杆菌BL21细胞，经IPTG诱导表达，利用SDS-PAGE和Western Blot鉴定表达产物，再将表达产物纯化后免疫21日龄SPF鸡；结果表明，重组菌在37 ℃培养条件下1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h可表达最多的可溶性重组蛋白，Western Blot分析表明，所表达的重组蛋白均能与禽腺病毒血清4型感染阳性血清发生特异性反应，说明所表达蛋白具有良好反应原性，动物试验表明，表达的两种目的蛋白能为鸡提供一定保护力，且低剂量的重组鞭毛-fiber2蛋白产生较好的免疫保护效果。

禽腺病毒4型 ； 鞭毛基因 ； fiber2基因 ； 原核表达 ； 免疫保护

腺病毒(Adenovirus，AdV)是家禽和野禽常见的传染性病原。近几年，由Ⅰ亚群禽腺病毒感染引起鸡的包涵体肝炎(Inclusion body hepatitis，IBH)、心包积水综合征(Hydropericardium syndrome，HPS)等临床病例逐渐增多并已遍及全世界。中国相继诊断和报道了大量IBH或HPS病例，其中以禽腺病毒4型感染居多；感染鸡可在没有呈现临床症状的情况下突然死亡，死亡率高达80%[1]，给养禽业造成巨大的经济损失[2]。

禽腺病毒4型(Fowladenovirusserotype4，FAdV-4)属于腺病毒科禽腺病毒属成员，是无囊膜双股DNA病毒，现已证实禽腺病毒有5个种(A-E)和12个血清型(1a-8a和8b-11b)[3-4]。FAdV-4衣壳由hexon、fiber和penton 3个主要结构蛋白组成，其中fiber和hexon是决定腺病毒衣壳蛋白抗原性的关键[5]，在哺乳动物对腺病毒的体液免疫应答中，fiber和hexon蛋白产生较多的特异性中和抗体[6-8]。研究报道FAdV-4 fiber-2蛋白具有良好的免疫原性，对鸡的包涵体肝炎-心包积水综合征具有很好的免疫保护作用[9]。鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白(flagellin)可刺激机体产生炎性因子，在连接天然免疫应答和获得性免疫应答中起重要作用[10]。最近研究发现，flagellin蛋白与猪圆环病毒2型Cap蛋白的融合重组蛋白能够诱导机体产生很好的体液和细胞免疫应答[11-12]。本研究拟将flagellin基因与FAdV-4 fiber2基因进行融合并对其表达的重组蛋白纯化，随后将重组蛋白flagellin-fiber2免疫无特定病原体(SPF)鸡，进行免疫保护性研究，为开发基因工程疫苗提供实验数据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 毒株、免疫血清及质粒 禽腺病毒血清4型(FAdV-4)HN2015毒株及其免疫鸡获得的阳性血清，原核表达载体pET-28a，大肠杆菌TOP10、BL21(DE3)感受态细胞均由北京市农林科学院畜牧兽医研究所高新技术研究室保存。

1.2 试剂 限制性内切酶SacⅠ、Hind Ⅲ、NotⅠ、T4 DNA连接酶，购自NEB公司；Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit、Ni-NTA Fast Start试剂盒，购自QIAGEN公司；抗His标签单克隆抗体、HRP标记的鼠抗鸡IgG和琼脂糖，购自Sigma公司；异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)和卡那霉素(Kan+)，购自Invitrogen公司；琼脂糖凝胶电泳染色剂Goldview，购自北京中生瑞泰科技有限公司；增强型HRP底物显色试剂盒，购自Thermo公司；MONTANIDE ISA 201 VG佐剂，购自SEPPIC公司。

1.3 fiber2和flagellin-fiber2基因引物的设计 根据实验室测得FAdV-4 HN2015毒株的基因序列，设计fiber2基因上下游引物fiber2-F和fiber2-R，并分别在上下游引物中插入SacⅠ和Hind Ⅲ酶切位点，引物序列为：fiber2-F：5′-AATGAGCTCATGCTCCGGGCCCCTAAAAGA-3′(下划线部分为SacⅠ酶切位点)，fiber2-R：5′-TAAGCTTACGGGAGGGAGGCCGCTGG-3′(下划线部分为HindⅢ酶切位点)。根据上海生工生物工程技术服务有限公司合成的flagellin-fiber2重组基因序列设计重组基因flagellin-fiber2上下游引物flagellin-fiber2-F、flagellin-fiber2-R，并插入SacⅠ和NotⅠ酶切位点，引物序列为：flagellin-fiber2-F：5′-GAGCTCGCGATGGCACAAGTAATCAACACT-3′(下划线部分为SacⅠ酶切位点)，flagellin-fiber2-R：5′-ATATATGCGGCCGCTATATATCGGGAGGGAGGCCGCTGGACA-3′(下划线部分为NotⅠ酶切位点)。引物由北京三博远志生物技术有限公司合成。

1.4 目的基因的PCR扩增 以FAdV-4 HN2015毒株中提取的病毒DNA和合成flagellin-fiber2基因为模版，按高保真PCR体系扩增fiber2和flagellin-fiber2基因，产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5 pET-28a-fiber2，pET-28a-flagellin-fiber2重组表达载体构建 将PCR扩增产物回收，用限制性内切酶SacⅠ+Hind Ⅲ分别同时酶切fiber2基因和pET-28a载体，用SacⅠ+NotⅠ酶切flagellin-fiber2基因和pET-28a载体。酶切产物进行胶回收，随后用T4 DNA连接酶将酶切产物于16 ℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌TOP 10感受态细胞，选取PCR鉴定为阳性的质粒进行测序。将测序正确的阳性质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。测序由睿博兴科生物技术有限公司完成。

1.6 fiber2和flagellin-fiber2蛋白表达及条件优化 挑取含阳性重组表达质粒和空质粒的单菌落接种于LB液体培养基(Kan+，50 mg/L)，37 ℃振荡培养过夜。次日按1∶100扩大培养，待OD600值达到0.4-0.6时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，240 r/min(37 ℃)振荡培养4、5、6、7 h，取5 mL不同时间诱导表达菌液，于6 000 r/min(4 ℃)离心15 min后收集细菌沉淀，沉淀加入SDS上样缓冲液，煮沸10 min，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，检测不同时间蛋白表达情况。

1.7 重组蛋白的Western Blot鉴定 将收集的细菌沉淀超声裂解后离心，取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白是否为可溶性表达。另取一块蛋白胶，加入上清进行SDS-PAGE后将蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，5%脱脂奶封闭NC膜2 h，PBST洗膜3次，10 min/次，加FAdV-4免疫阳性血清孵育2 h；洗膜后加HRP标记的鼠抗鸡IgG二抗孵育2 h；洗膜后加增强型HRP底物显色液避光反应5 min后成像，检测是否为目的蛋白。

1.8 重组蛋白的纯化 将收集的细菌沉淀加入裂解液超声30 min，每次超声5 s间隔10 s，10 000 r/min离心15 min后，取上清加到平衡好的镍柱中，按照Ni-NTA Fast Start蛋白纯化试剂盒说明书进行目的蛋白纯化。

1.9 重组蛋白对SPF鸡的免疫保护试验 重组蛋白的制备：将fiber2、flagellin-fiber2重组蛋白与佐剂等体积混合，免疫剂量fiber2蛋白50 μg/只，flagellin-fiber2蛋白分别为20 μg/只和50 μg/只。重组蛋白免疫试验：将32只21日龄SPF鸡分成4组，每组8只，分别为阴性对照组、fiber2-50 μg组、flagellin-fiber2-50 μg组、flagellin-fiber2-20 μg组，分别胸肌多点注射免疫蛋白，阴性对照组注射PBS。免疫鸡攻毒试验：免疫后21 d，4组分别肌肉接种FAdV-4毒，102.0EID50/0.2 mL，接种0.4 mL/只。攻毒后，每天监测鸡的发病情况，对死亡鸡进行剖检观察病理变化，评价重组蛋白的免疫保护力。

2 结果

2.1 目的基因PCR扩增 结果显示fiber2和flagellin-fiber2基因片段的大小与预期结果一致(图1、2)。

图1 fiber2基因PCR鉴定M：2 000 bp DNA分子量标准；1：fiber2基因； 2：阴性对照

图2 flagellin-fiber2基因PCR鉴定M：15 000 bp DNA分子量标准；1：阴性对照； 2：flagellin-fiber2基因

2.2 重组质粒鉴定 挑取单菌落进行菌落PCR鉴定阳性结果(图3、4)。

2.3 重组蛋白最佳诱导表达条件确定 由SDS-PAGE和Western Blot检测结果(图5、6)可知，重组蛋白在37 ℃诱导表达6 h时效果最佳，且与预期目的条带大小相符。

图3 质粒PCR鉴定M：2 000 bp DNA分子量标准；1～4：pET-28a-fiber2

图4 质粒PCR鉴定M：15 000 bp DNA分子量标准；1～4：pET-28a-flagellin-fiber2

图5 pET-28a-fiber2在大肠杆菌中表达SDS-PAGE(a)和Western Blot(b)鉴定M：蛋白质分子量标准； 1：pET-28a空载体诱导7 h;2～5：分别为37 ℃ pET-28a-fiber2诱导7、6、5、4 h

图6 pET-28a-flagellin-fiber2在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE(a)和Western Blot(b)鉴定M：蛋白质分子量标准； 1～4：分别为37 ℃ pET-28a-flagellin-fiber2诱导4、5、6、7 h;5：pET-28a空载体诱导7 h

2.4 表达产物的纯化 两种融合表达蛋白均在上清中表达，用镍亲和层析柱蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白(图7、8)。

图7 纯化fiber2蛋白SDS-PAGE鉴定M：蛋白质分子量标准； 1纯化后的fiber2蛋白

图8 纯化flagellin-fiber2蛋白SDS-PAGE鉴定M：蛋白质分子量标准；1:纯化后的flagellin-fiber2蛋白

2.5 表达产物的Western Blot检测 FAdV-4感染阳性血清与目的蛋白分别在59 kDa和110 kDa处发生反应，与预期结果相符(图9、10)，说明两重组蛋白具有良好的反应原性。

图9 纯化的fiber2蛋白Western Blot鉴定M：蛋白质分子量标准；1：纯化后fiber2蛋白

图10 纯化的flagellin-fiber2蛋白Western Blot鉴定M：蛋白质分子量标准；1：纯化后flagellin-fiber2蛋白

2.6 攻毒保护试验 阴性对照攻毒组鸡死亡率为87.5%(7/8)，flagellin-fiber2-50 μg组为37.5%(3/8)，flagellin-fiber2-20 μg组为25%(2/8)，fiber2-50 μg组为25%(2/8)，免疫组较阴性对照组有明显的保护作用，且flagellin-fiber2-20 μg组和fiber2-50 μg组免疫效果较好，优于flagellin-fiber2-50 μg组(图11)。对病死鸡剖检可见典型的心包积液和肝脏肿大。

图11 各实验组免疫攻毒后鸡死亡率

3 结论与讨论

有研究表明，禽腺病毒4型流行普遍，在国内流行严重[13]，随着我国养禽业迅速发展，其发病率、病死率逐年上升，作为一种高传染性和高死亡率的家禽疾病危害严重[14]。在心包积水综合征流行严重的国家，研制自家疫苗对本病预防有一定效果，但存在保护效果不稳定和继发感染等问题[15]。目前针对FAdV-4引起的禽心包积水-包涵体肝炎综合征，国内尚无商品化疫苗防控感染，又因fiber2基因可诱导产生较多抗体，鞭毛蛋白能够增强免疫应答，基于以上几点研制针对该病安全高效的亚单位疫苗至关重要。

为此本试验利用原核表达系统，构建了pET-28a-fiber2、pET-28a-flagellin-fiber2重组表达载体，在大肠杆菌中进行表达，纯化出较高浓度重组蛋白。将纯化蛋白免疫SPF鸡，分别用佐剂+fiber2-50 μg、佐剂+flagellin-fiber2-20 μg、佐剂+flagellin-fiber2-50 μg组免疫后接种FAdV-4，结果显示，对试验鸡均有不同程度免疫保护效果，比较不同蛋白剂量免疫对鸡的保护效果发现，flagellin-fiber2融合蛋白免疫组较低免疫剂量时保护效果好，对鸡的保护力并没随免疫剂量的增大而升高，免疫剂量增加保护力随之降低，说明表达的鞭毛蛋白与外源抗原的融合重组蛋白免疫要达到最好效果的使用剂量可能和外源抗原种类相关，柳舒航[16]的IBDV VP2蛋白与鞭毛重组蛋白免疫原性研究中，也呈现较低剂量鞭毛融合蛋白免疫效果较高剂量好的趋势。本试验中，flagellin-fiber2-20 μg组与fiber2-50 μg组保护率相同，诱导相同程度免疫反应时，鞭毛融合蛋白免疫剂量小于单独外源抗原免疫剂量，与Huleatt J W[17]等人研究结果一致。此外，鞭毛融合蛋白免疫效果未高于单独fiber2免疫组，可能是鞭毛蛋白在与fiber2蛋白融合表达后，未独立折叠，空间结构受到干扰，使鞭毛蛋白增强免疫的作用受到影响，使保护力未达到理想结果，其机制仍需进一步研究。同时若将flagellin-fiber2-20 μg/只和fiber2-50 μg/只免疫应用于临床实践中，flagellin-fiber2-20 μg可明显较fiber2-50 μg节约一定成本；因此本研究为亚单位疫苗的研制奠定基础。

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Study on expression of recombinant flagellin-fiber2 protein and its immunoprotective effects

LIU Chao1，2， HOU Lei2， WEI Li2， WANG Jing2， QUAN Rong2， ZHU Shan-shan2，LI Zi-xuan2， QI Bin-bin2， WANG Li-jia1，2， JIANG Hai-jun2， WANG Dan2， LIU Jue2

(1.Animal Science and Techolagy College， Beijing University Of Agriculture， Beijing 102206， China； 2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Beijing 100097， China)

The study was to investigate the immunoprotective effects in specific pathogen free (SPF) chickens for recombinant flagellin-fiber2-protein of fowl adenovirus (FAdV) serotype 4. A recombinant gene that was designed by fusing a modified version ofSalmonellatyphimuriumflagellin to FAdV-4 fiber2 gene and a fiber2 gene were cloned into the pET-28a vector for expression inEscherichiacoliBL21. The recombinant proteins were analyzed by SDS-PAGE and Western Blot,and then were used to immunize 21 day-old SPF chickens. The recombinant proteins were induced with 1 mmol/L isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) for 6 h at 37 ℃. Western Blot results showed that the proteins had specific reaction against FADV-4 positive serum,implying that these proteins had good reactivity with the positive serum. Animal test results indicated that the two proteins protect SPF birds from challenge. Moreover,the protective effect of low-dose recombinant flagellin-fiber2 protein was better.

Fowl adenovirus serotype 4 ; flagellin-fiber2 ; prokaryotic expression ; protective effect

LIU Jue

2017-02-27

北京市农林科学院青年科研基金(QNJJ2016)

刘超(1991-)，女，硕士生，研究方向为畜禽疾病诊治，E-mail:15210872560@139.com

刘爵，E-mail:liujue@263.net

S852.65

A

0529-6005(2017)05-0015-05