江西省布鲁菌分离株的鉴定及分子特征分析*

熊长辉，徐建民，杨 梦，宗 俊，潘欢弘，刘晓青

江西省疾病预防控制中心,江西南昌 330029

布鲁菌病是由于感染布鲁菌引起的人兽共患传染病。我国引起布鲁菌病的病原菌以羊种布鲁菌居多，其中又以羊种3型布鲁菌为主[1]。为了解江西省近年来布鲁菌病流行情况，本研究对江西省近几年分离的布鲁菌进行鉴定和基因多态性分析。

1 材料与方法

1.1菌株来源 近几年从江西省布鲁菌病监测点及医院送检标本中分离得到的布鲁菌32株。

1.2仪器与试剂

1.2.1主要仪器 生物安全柜(美国Thermo)、培养箱(日本EYELA SLI-1200)、超净工作台(江苏苏净)、PCR仪(美国Bio-Rad)、自动凝胶成像仪(美国Bio-Rad)、高速冷冻离心机(德国Sigma 3-18K)、微量高速离心机(德国Eppendorf)。

1.2.2主要试剂及耗材 PCR引物(上海生工公司合成)、布氏琼脂(BBL公司)、普通琼脂糖(Geng公司)、细菌DNA提取试剂盒(凯杰生物)、PCR相关试剂均为大连宝生物公司产品。

1.3方法

1.3.1细菌基因组DNA的提取 从平板上挑取纯化培养后的布鲁菌先灭活，再按照试剂盒说明书操作步骤，提取布鲁菌的DNA，于-20 ℃保存备用。

1.3.2布鲁菌表面蛋白31(BCSP31)PCR鉴定 参考文献[2],用BCSP31-PCR对布鲁菌进行鉴定。

1.3.3AMOS-PCR鉴定 参考文献[2]，用AMOS-PCRρ[A、M、O、S分别为牛(Abortus)、羊(Melitensis)、绵羊(Ovis)、猪(Suits)首字母的缩写]进行布鲁菌菌种的鉴定。

1.3.4rpoB基因检测 布鲁菌rpoB基因的PCR扩增，上、下游引物分别为rpoB-F：5′-ATGGCTCAGACCCATTCTTTC-3′，rpoB-R：5′-TTATTCTGCCGCGTCCGGAA-3′。反应体系(25 μL)：10×缓冲液2.5 μL，脱氧核苷三磷酸(dNTPs)2 μL，rpoB上、下游引物各1 μL，Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，去离子超纯水17 μL，模板1 μL。PCR条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.3.5rpoB-PCR产物测序 PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，获得特异性目的条带，并且送上海生工测序。测序结果用MEGA6.0软件分析。

2 结 果

2.1BCSP31-PCR鉴定 所有菌株DNA的BCSP31-PCR产物经电泳，均显示出布鲁菌特异性条带，部分菌株的BCSP31-PCR产物电泳结果见图1。

注：M为分子标准带；1～13为布鲁菌BCSP31-PCR产物；+为阳性对照；-为阴性对照。

2.2AMOS-PCR鉴定 所有菌株DNA AMOS-PCR产物经电泳，均显示出731 bp的羊种布鲁菌特异性条带，部分菌株的AMOS-PCR产物电泳结果见图2。

注：M为分子标准带；1～13为布鲁菌AMOS-PCR产物；+为阳性对照；-为阴性对照。

2.3rpoB基因检测 所有菌株DNA的rpoB基因PCR产物经电泳，均显示出4 300 bp的特异性条带，部分菌株的rpoB基因PCR产物的电泳结果见图3。

注：M为分子标准带；1～16为布鲁菌rpoB基因PCR产物。

2.4rpoB-PCR扩增产物测序 通过MEGA6.0软件分析其序列，N-J法构建系统发育树，参数设置为“bootrap=500”“cutoff=90%”，羊种布鲁菌rpoB基因高度同源，见图4。

图4 羊种布鲁菌rpoB基因的系统进化树

3 讨 论

布鲁菌病是全球范围的动物源性人兽共患传染病[3]，据统计全球每年约有50万布鲁菌病新增病例[4-6]。并且布鲁菌病感染早期症状与其他发热性疾病症状非常相似，许多患者在发病早期极易被误诊为其他发热性疾病，因此，探讨布鲁菌病患者早期快速诊断的方法对患者的治疗和预后有积极的意义。尽管目前布鲁菌病的诊断技术有了较大的提升，但仍存在诊断技术原因导致的误诊和延迟诊断[7]。随着分子生物学的不断发展，PCR检测技术广泛应用于布鲁菌的诊断，目前文献报道的PCR方法很多，布鲁菌属水平的检测一般用普通PCR，其中主要是以BCSP31(B4/B5)、16S rRNA、Virb8，外膜蛋omp25、omp31、LSP pgm等基因为依据设计引物[8-10]，而种水平的鉴定则用多重PCR方法，比如AMOS-PCR[11]。BCSP31是布鲁菌中的一种免疫原性膜蛋白，存在于布鲁菌的各种型菌株中，根据BCSP31蛋白的基因设计B4-B5引物进行PCR，各种型菌株均可出现特异性扩增产物[12]。AMOS-PCR检测方法可从属的水平上鉴定布鲁菌，但不能区分具体种型。有文献报道显示，羊种菌依然是当前主要流行种型，牛种菌次之，由此可见AMOS-PCR检测方法可以涵盖国内的流行菌株，有较高的应用价值[13]。本研究采用BCSP31基因对近年江西省分离的布鲁菌菌株进行鉴定，采取AMOS-PCR进行布鲁菌菌种的鉴定，结果显示江西省近年人感染的布鲁菌均为羊种布鲁菌。rpoB基因编码DNA依赖的RNA聚合酶β亚单位，是一个高度保守的管家基因，也常被用作细菌鉴定的标志基因和系统发育分析的位点[14-15]。基于16S rRNA的分析被普遍认为能鉴定细菌至属水平，而不能解决近缘种之间的分类问题[16-17]。rpoB基因表现出比16S rRNA更大的优越性。李旦等[18]通过对布鲁菌rpoB基因的研究，认为rpoB基因能用于鉴定所有的布鲁菌种及大部分的生物变种。ADEKAMBI等[19]认为，rpoB基因测序能准确反映细菌的鸟嘌呤加胞嘧啶的百分含量，DNA-DNA杂交水平及平均核苷酸同源性(2个菌株共享的全基因组序列的比例)，能在种和亚种水平反映细菌系统发育关系，可作为一个强有力的微生物鉴定工具。本研究对近年江西省分离的布鲁菌菌株rpoB基因序列进行了同源分析，结果表明与江西省近年人感染的羊种布鲁菌rpoB基因序列高度同源。本研究利用BCSP31-PCR和AMOS-PCR对江西省分离的布鲁菌进行了鉴定和分型，利用rpoB基因序列进行同源分析，建立了用于布鲁菌实验室鉴定和分型的方法，为布鲁菌病的监测和疫情的处置提供了更快捷的实验室检测手段。