血清循环miR-103a-2在非酒精性脂肪性肝病中的表达及意义*

王旭，李丹妮，付俣萧，冯辉

(1.中国医科大学基础医学院免疫学教研室，沈阳 110122；2.鞍山市中心医院检验科，辽宁鞍山 114001)

·临床实验研究·

血清循环miR-103a-2在非酒精性脂肪性肝病中的表达及意义*

王旭1,2，李丹妮1，付俣萧1，冯辉1

(1.中国医科大学基础医学院免疫学教研室，沈阳 110122；2.鞍山市中心医院检验科，辽宁鞍山 114001)

目的 探讨miR-103作为非侵袭性生物学标志物对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)代谢异常的筛查意义。方法 以健康人群和NAFLD患者为研究对象，采集血清样本进行生化指标检测。采用NucleoZOL法分离血清miRNA，SYBR Green法对miR-103a-2进行相对定量分析。Speraman法对miR-103a-2和生化指标进行相关性分析。结果 血清学分析结果显示，与健康人对照组相比，NAFLD组TC(P<0.01)、TG(P<0.01)、ALT(P<0.01)和γ-GGT(P<0.01)水平均明显升高。与血脂正常NAFLD组相比，高脂血症NAFLD组中TC(P<0.01)、TG(P<0.01)和LDL-C(P<0.05)水平均明显升高，与健康人对照组相比，血脂正常NAFLD患者(P<0.05)和伴有高血脂症NAFLD患者(P<0.01)血清miR-103a-2表达水平均升高。血清miR-103a-2水平与血清TC水平呈正相关(r=0.495，P=0.001)。 结论 血清miR-103a-2较血脂更为敏感，可能成为NAFLD无创性筛查指标。

非酒精性脂肪肝；高脂血症；miRNA；miR-103a；荧光实时定量PCR

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)可由简单的脂肪变性最终进展为肝硬化或肝细胞性肝癌[1]。肝脏活组织检查虽然是NAFLD诊断金标准，但其为创伤性诊断而不能在临床广泛开展。为此，筛选NAFLD诊断相关的特异性指标成为人们关注的焦点。循环miRNA已成为多种疾病的候选生物学标志物[2]，特别是作为非侵袭性生物学标志物在肝脏疾病预测和诊断中具有特殊价值。本研究旨在探讨NAFLD患者外周血miR-103表达水平，并与肝脏脂代谢指标进行相关性分析，以评估血清miR-103表达对肝脏代谢异常的筛查意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2015年03月至2016年10月鞍山市中心医院就诊的NAFLD患者56例，诊断依据均符合中华医学会肝病学分会《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版)》[3]，并进一步根据高脂血症诊断标准《中国成人血脂异常防治指南_2016年修订版》[4]将NAFLD组分为血脂正常NAFLD组(n=25，男13例，女12例，年龄36～55岁，中位年龄46.3岁)和高脂血症NAFLD组(n=31，男15例，女16例，年龄38～68岁，中位年龄53.8岁)。均排除糖尿病、高血压、肿瘤、慢性系统性疾病及严重肾功能不全。收集同期本院体检健康者作为健康人对照组(n=20，男9例，女11例，年龄31～49岁，中位年龄45.3岁)。本研究经医院医学伦理学委员会批准，各研究对象知情同意。

1.2 主要试剂和仪器 NucleoZOL试剂(德国MN公司)；miDETECTTMmiRNA qRT-PCR标准品RNA及Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR(锐博生物公司)；腹部彩色多普勒超声诊断仪(意大利Esaote公司)；生化分析检测仪及配套试剂盒(日本Olympus公司)；荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；NanoDrop 2000超微量分光光度计(美国Thermo Scientific公司)。

1.3 标本采集 采集各研究对象清晨空腹静脉血5 mL，3 000 r/min离心10 min，吸取部分血清置于无RNase/DNase Ep管中，-80 ℃保存。剩余血清2 h内完成各项生化指标检测。

1.4 各生化指标检测 用生化分析检测仪及配套试剂盒检测丙氨酸氨基转移酶(ALT，NADH法)、碱性磷酸酶(ALP，磷酸对硝基苯法)、γ-谷氨酰基转移酶(γ-GGT，速率法)、总蛋白(TP，双缩脲法)和清蛋白(Alb,溴甲酚绿法)及总胆固醇(TC，酶法)、三酰甘油(TG，磷酸甘油氧化酶法)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C，过氧化氢清除法)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C，表面活剂清除法)、葡萄糖(Glu，己糖激酶法)、尿素(Urea，尿素酶法)和肌酐(Cr，肌氨酸氧化酶法)。

1.5 血清miRNA提取及逆转录 取血清样本400 μL， 按照NucleoZOL试剂说明书操作提取miRNA。NanoDrop 2000微量分光光度计检测RNA浓度，取吸光度(A260/280 nm)在1.8～2.0的样本用于后续实验。按照Bulge-LoopTMmiRNA RT-PCR 说明书操作将RNA逆转录为cDNA，样本置-20 ℃保存。

1.6 实时荧光定量PCR Hsa-miR-103a-2-5p和cel-miR-39外参照引物由锐博生物公司设计并合成。Hsa-miR-103a-2-5p引物序列(MIMAT0009196)：5′-AGCUUCUUUACAGUGCUGCCUUG-3′；cel-miR-39-5p引物序列(MIMAT0020306)：5′-AGCUGAUUUCGUCU

UGGUAAUA-3′，通用下游引物为试剂盒自带。荧光定量PCR反应体系为10 μL，包括2×SYBR Green Mix 5 μL、50×ROX reference dye Ⅱ0.2 μL、Bulge-LoopTMmiRNA上、下游引物(5 μmol/L)各0.4 μL、cDNA 1 μL、Rnase-free H2O 3 μL。循环参数：95 ℃ 10 min；95 ℃ 2 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，共40个循环。以cel-miR-39为外参照基因，Rnase-free H2O为阴性对照。用Thermo Scientific 7500软件采集荧光信号并进行熔解曲线分析，Hsa-miR-103a-2-5p相对表达量以2-△△Ct法计算。每组设3个复孔，实验重复3次。

2 结果

2.1 各组间血清学比较结果 各组在TC、TG、LDL-C、ALT、γ-GGT、TP和Glu表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)；组间两两比较结果表明，与健康人对照组相比，NAFLD组TC(P<0.01)、TG(P<0.01)、ALT(P<0.01)和γ-GGT(P<0.01)水平差异有统计学意义。而与血脂正常NAFLD组相比，高脂血症NAFLD组TC(P<0.01)、TG(P<0.01)和LDL-C(P<0.05)表达水平差异亦有统计学意义。见表1。

2.2 hsa-miR-103a-2-5p相对定量分析结果 与健康人对照组相比，血脂正常NAFLD患者(t=3.534,P<0.05)和伴有高血脂症NAFLD患者(t=4.15,P<0.01)血清miR-103a-2表达水平均升高，差异均具有统计学意义。见图1。

2.3 hsa-miR-103a-2-5p表达与NAFLD患者血清生化指标的相关性分析 对miR-103a-2-5p表达量分别与TC、TG、HDL-C、LDL-C进行相关性分析，结果表明，其与TC(r=0.495，P=0.001)呈正相关，而与TG(r=0.054，P=0.6425)、与HDL-C(r=0.344，P=0.075)和LDL-C(r=0.331，P=0.07)无相关性。

表1 血清生化指标水平比较

注：与健康人对照组相比，#,P<0.05；与NAFLD血脂正常组相比，*,P<0.05。

注：与健康人对照组相比，#,P<0.05, ##,P<0.01。

图1 各组miR-103a-2-5p相对定量表达水平比较

3 讨论

最近一项NAFLD肝组织活检miRNA表达谱系研究分析了1 438个人类miRNAs，发现miR-103a-2是与NAFLD发病相关肝源性miRNA新型候选miRNA之一[5]。而血清miR-103a-2在NAFLD表达及临床意义尚不明确。以往的研究显示，miR-103在糖尿病小鼠模型中表达上调，参与胰岛素抵抗[6]；另有学者认为，miR-103在神经痛小鼠模型中表达下调，表明其可能参与疼痛的缓解[7]。本研究发现血清miR-103a-2在NAFLD组内表达水平升高(P<0.01)。特别是在伴有高血脂症NAFLD患者中升高更为明显(P<0.01)。由此提示，血清miR-103a可能参与NAFLD的发生与发展。本研究对血清生化指标分析发现，与健康人对照组相比，NAFLD组中TC、TG、ALT和γ-GGT水平表达存在统计学差异。由此表明，肝脏脂肪变性后代谢功能出现紊乱，进而导致血脂和肝功能出现异常。相关性分析显示，血清miR-103a-2-5p与血清TC水平呈正相关(r=0.49)，进而提示血清miR-103a-2可能成为较血脂更为敏感的NAFLD检测指标，为NAFLD无创性筛查提供新手段。本研究仍存在不足之处，如收集的病例数偏少，未对NAFLD进行随访资料收集及分析，今后我们将继续收集病例，完善资料，并进一步分析miR-103a-2-5p与其他血清标志物联合检测用于NAFLD的临床筛查及诊断。

[1]Lee J, Kim Y, Friso S,etal. Epigenetics in non-alcoholic fatty liver disease[J]. Mol Aspects Med, 2017, 54:78-88.

[2]焦志军. 循环microRNA：潜在的疾病诊断生物标志物[J]. 临床检验杂志, 2012, 30(10):850-856.

[3]中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组. 非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版)[J]. 中国肝脏病杂志(电子版), 2010, 2(4):43-48.

[4]中国成人血脂异常防治指南修订联合委员会. 中国成人血脂异常防治指南_2016年修订版[J]. 中国循环杂志, 2016, 31(10):937-953.

[5]Soronen J, Yki-Jarvinen H, Zhou Y,etal. Novel hepatic microRNAs upregulated in human nonalcoholic fatty liver disease[J]. Physiol Rep, 2016, 4(1): e12661.

[6]Trajkovski M, Hausser J, Soutschek J,etal. MicroRNAs 103 and 107 regulate insulin sensitivity[J]. Nature, 2011, 474(7353):649-653.

[7]Favereaux A, Thoumine O, Bouali-Benazzouz R,etal. Bidirectional integrative regulation of Cav1.2 calcium channel by microRNA miR-103: role in pain[J]. EMBO J, 2011, 30(18):3830-3841.

(本文编辑：许晓蒙)

Expression and clinical significance of circulating miR-103a-2 in serum from patients with nonalcoholic fatty liver disease

WANGXu1,2，LIDan-ni1，FUYu-xiao1，FENGHui1

(1.DepartmentofImmunology,CollegeofBasicMedicalSciences,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,AnshanCentralHospital,Anshan114001,Liaoning,China)

Objective To investigate the significance of miR-103 as noninvasive biomarker for diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). Methods The serum samples were collected from healthy subjects and NALFD patients to detect biochemical parameters. NucleoZOL method was used to isolate serum miRNA. SYBR Green qPCR was used for relatively quantitative analysis of miR-103a-2. The correlations between miR-103a-2 and biochemical parameters were analyzed by Spearman method. Results Compared with healthy control group, the levels of total cholesterol (TC), triacylglyceride (TG), alanine aminotransferase (ALT) and glutamyl transpeptidase (γ-GGT) were all significantly increased in NAFLD group (P<0.01). Compared with the NAFLD group accompanying ortholiposis, the levels of TC, TG and low density lipoprotein-cholesterol (LDL-C) were all significantly increased in the NAFLD group accompanying dyslipidemia (P<0.01). Compared with the healthy control group, the level of serum miR-103a-2 increased in both NAFLD with ortholiposis group (P<0.05) and NAFLD with dyslipidemia group (P<0.01). The level of serum miR-103a-2 was positively correlated with serum TC (r=0.495,P=0.001). Conclusion Serum miR-103a-2 may be a more sensitive parameter for noninvasive screening of NAFLD than the parameters of blood lipid.

nonalcoholic fatty liver disease; hyperlipemia; miRNA; miR-103a; fluorescent real-time quantitative PCR

10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.07

辽宁省高等学校杰出青年学者成长计划(LJQ2014081)。

王旭，1977年生，男，副主任技师，硕士，从事临床免疫检验工作。

冯辉，副教授，博士，E-mail：hfeng@cmu.edu.cn。

R446.19

A

2017-03-07)