LXR异常激活上调p27蛋白致胰岛β细胞周期阻滞*
2017-06-19毛旭华汤俊明乔国洪冯斯依韩晓井昶雯
毛旭华,汤俊明,乔国洪,冯斯依,韩晓,井昶雯
(1.宜兴市人民医院检验科,江苏宜兴 214200;2.南京医科大学人类功能基因组实验室,南京 211166; 3.南京医科大学附属肿瘤医院,江苏省肿瘤防治研究所,江苏省肿瘤医院临床肿瘤实验中心,南京 210009)
·调查研究·
LXR异常激活上调p27蛋白致胰岛β细胞周期阻滞*
毛旭华1,汤俊明1,乔国洪1,冯斯依1,韩晓2,井昶雯3
(1.宜兴市人民医院检验科,江苏宜兴 214200;2.南京医科大学人类功能基因组实验室,南京 211166; 3.南京医科大学附属肿瘤医院,江苏省肿瘤防治研究所,江苏省肿瘤医院临床肿瘤实验中心,南京 210009)
目的 探讨肝X受体(liver X receptors, LXR)激动剂对小鼠胰岛β细胞系MIN6的作用。方法 LXR激动剂T0901317作用于MIN6细胞后,CCK-8法检测细胞活力;流式细胞仪检测细胞周期变化;实时定量RT-PCR法检测S期激酶相关蛋白2(Skp2)和p27 mRNA的表达水平;western blot检测Skp2和p27蛋白的表达情况。结果 与control组相比,1、5和10 μmol/L药物处理后的细胞存活率分别为(98.54±0.94)%、(87.03±0.93)%和(75.57±1.85)%,各组间差异有统计学意义(F=301.90,P<0.01)。与control组G1期(35.93±2.25)%和S期(52.87±1.19)%相比,1、5和10 μmol/L药物处理组G1期细胞比例分别为(38.45±0.91)%、(45.46±1.34)%和(53.28±1.14)%,差异有统计学意义(F=80.83,P<0.01)。S期细胞比例分别为(48.65±0.85)%、(36.31±1.37)%和(31.45±1.22)%,差异有统计学意义(F=221.30,P<0.01)。10 μmol/L T0901317处理组p27蛋白表达水平(2.84±0.14)明显高于control 组 (2.28±0.10),差异有统计学意义(t=4.54,P<0.05)。但两组间p27 mRNA 水平差异无统计学意义(t=0.28,P>0.05)。10 μmol/L T0901317下调Skp2 mRNA(0.52±0.02,t=29.22,P<0.01)和蛋白质水平(相对灰度值为0.98±0.12,control 组为1.89±0.01,t=10.98,P<0.01)。以对照组(100%)为参照,转染组、药物处理组和干扰组的细胞存活率分别为(100.97±1.08)%、(75.03±1.83)%和(86.67±2.45)%,与对照组比较,转染组间差异无统计学意义(t=1.542,P>0.05),药物处理组细胞活力下降(t=23.58,P<0.01);药物处理组和干扰组间差异亦有统计学意义(t=7.77,P<0.01)。结论 LXR异常激活可导致胰岛β细胞增殖抑制,p27蛋白表达量增加,其机制可能为降解调控p27蛋白的Skp2 mRNA和蛋白质表达水平下降。
2型糖尿病;肝X受体激动剂;p27;S期激酶相关蛋白2;细胞周期阻滞
肝X受体(liver X receptors, LXR) 是调节脂质代谢、细胞增殖和凋亡的重要核受体家族成员。多项研究表明,LXR异常激活能抑制多种肿瘤(如卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等)的细胞增殖,诱导细胞凋亡[1-2]。本研究旨在用LXR激动剂T0901317刺激小鼠胰岛β细胞系MIN6,通过CCK-8法和流式细胞仪检测其细胞活力和细胞周期改变,分析LXR异常激活对胰岛β细胞活力的影响;并通过检测Skp2、p27 mRNA和蛋白质水平,探讨其主要的分子作用机制。
1 材料与方法
1.1 细胞系、主要试剂和仪器 小鼠胰岛β细胞系MIN6购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库;p27小干扰片段购自广州锐博公司;胎牛血清、DMEM培养基(美国Gibco公司);LXR激动剂T0901317(美国Cayman Chemical公司);Lipofectamine 2000转染试剂、Trizol试剂(美国Invitrogen公司);RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒(日本ToYoBo公司); 细胞蛋白裂解液RIPA(美国Biomiga公司);蛋白酶抑制剂PMSF(美国CST公司);曝光液、PVDF膜(德国Millipore公司),BCA法蛋白质提取试剂盒(碧云天公司);兔抗人p27、Skp2多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);兔抗人β-actin多克隆抗体(美国Sigma公司),辣根过氧化物酶标记的羊抗兔及抗鼠IgG(美国Amersham Pharmacia公司);活细胞计数试剂盒(日本株式会社同仁化学研究所)。CO2培养箱和生物安全柜(美国Thermo公司);酶联仪(美国Biotek公司);BD FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司);ABI 7300荧光定量PCR仪(美国ABI公司);NanoDrop 2000超微量分光光度计(美国Thermo Scientific公司);蛋白质电泳仪(美国Bio-Rad公司),光学显微镜(日本Olympus公司)。
1.2 细胞培养 取生长状态良好的MIN6细胞,贴壁生长于含50 μmol/L、β-巯基乙醇、25 mmol/L葡萄糖、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和15%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液中。置于37 ℃、5% CO2培养箱内传代培养。
1.3 CCK-8法测定细胞存活率 取对数生长期的MIN6细胞,经胰蛋白酶-EDTA消化液(含2.5 g/L胰蛋白酶+0.53 mmol/L EDTA)消化成单细胞悬液,以1×105/mL的细胞密度接种于96孔细胞培养板中,每孔接种100 μL。细胞贴壁后,分别加入不同浓度的T0901317(1、5、10 μmol/L),每个浓度设4个复孔。同时设立正常对照组(仅加细胞)及空白调零组(仅加培养液)。培养48 h后去除孔内培养液,加入100 μL培养基和10 μL CCK-8混合液继续温育1 h后置于酶联仪中以490 nm波长测定各孔吸光度(A490 nm)值。实验重复3次,细胞存活率=(1-实验组A490 nm值/对照组A490 nm值)×100%。
1.4 流式细胞仪(FCM)检测细胞周期 取上述MIN6细胞,以5×105/孔的细胞密度接种于6孔细胞培养板中。细胞贴壁后加入不同浓度(0、1、5、10 μmol/L)的T0901317,常规培养48 h后,弃去培养液,经2.5 g/L胰蛋白酶消化后,制成单细胞悬液(加入PBS振荡后以1 400 r/min,离心7 min,弃上清液),再经预冷的PBS洗涤2次,加入75%乙醇1 mL,-20 ℃固定过夜;次日,室温300 r/min离心6 min;弃上清,加入1 mL PBS重悬细胞沉淀;室温300 r/min离心6 min;弃上清,各管加入500 μL碘化丙啶(PI)染液(50 μg/mL PI和含25 μg/mL RNA酶的PBS)重悬细胞沉淀,室温、避光温育30 min;然后上机检测。收集20 000个细胞的荧光信号。结果用ModFIT高精度DNA自动分析软件分析。
1.5 总RNA提取及逆转录反应 取上述MIN6细胞,以5×105/孔的细胞密度接种于6孔细胞培养板中,实验分为2个组:control组(即不加药组)和T0901317处理组(10 μmol/L)。常规培养48 h后收集细胞,用Trizol试剂提取总RNA,并按照逆转录试剂盒说明书操作将总RNA逆转录为cDNA,样本置-20 ℃保存。
1.6 实时荧光定量RT-PCR检测 从GenBank中检索p27、Skp2及β-actin的基因序列(序列号分别为NM_009875、NM_013787、NM_007393),用Primer Premier 5.0软件设计引物序列,并经BLAST分析,确定其特异性,所有引物均由上海生工公司合成。p27上游引物序列(5′→3′):GGCCCGGTCAATCATG
AA;下游引物序列(5′→3′):CATATCCCGGCAGTGC
TTCT。Skp2上游引物序列(5′→3′):AGCCGCTGGG
TGAAAGC;下游引物序列(5′→3′):TCACTGAGTTC
GACAGGTCCAT。β-actin上游引物序列(5′→3′):AGGCCAACCGTGAAAAGATG;下游引物序列(5′→3′):AGAGCATAGCCCTCGTAGATGG。PCR总反应体系为20 μL,包括10 μmol/L上、下游引物各1 μL,10 μmol/L dNTPs 4 μL,10×PCR buffer 1 μL,模板DNA 1 μL,无菌ddH2O补足体积。反应条件:95 ℃预变性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 31 s,共40个循环。结果以2-ΔΔCt法计算,公式:-ΔΔCt=[(实验组Ct目的基因-实验组Ct内参基因)- (对照组Ct目的基因-对照组Ct内参基因)]。实验重复3 次。
1.7 western blot 取上述MIN6细胞,以5×105/孔的细胞密度接种于6孔细胞培养板中。实验分为2个组:control 组(即不加药组)和T0901317处理组(10 μmol/L)。常规培养48 h后收集细胞,RIPA蛋白裂解液裂解细胞并抽提蛋白质,BCA法测定蛋白质浓度。配制12% SDS-PAGE分离胶,将上述蛋白质样品变性后按50 μg总蛋白质量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(积层胶采用80 V电压,分离胶采用100 V电压)。电泳结束后在250 mA恒流条件下90 min将蛋白质转移至PVDF膜上,转膜结束后将膜置于50 g/L脱脂牛奶中室温封闭1 h,以封闭膜上的非特异性蛋白结合位点;加入兔抗人p27抗体(1∶800稀释)、兔抗人Skp2抗体(1∶600稀释)及兔抗人β-actin抗体(1∶4 000稀释),4 ℃温育过夜。TBST洗膜3次,加入HRP标记的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(1∶4 000稀释)37 ℃温育1 h;TBST洗膜3次;曝光并采用Image J 4.1软件对条带进行灰度扫描进行结果判读,试验重复3次。
1.8 细胞转染 取上述MIN6细胞,以5×105/孔的细胞密度接种于6 孔细胞培养板中。常规培养16~24 h后进行细胞转染。脂质体混合液体系及反应条件:Lipofectamine 2000试剂5 μL、无血清培养基245 μL。将混合液体系室温温育5 min。寡核苷酸片段混合液转染体系及反应条件:50 nmol/L p27 siRNA 5 μL、无血清培养基245 μL;将250 μL脂质体混合液加入250 μL寡核苷酸片段混合液中,轻轻混匀,室温静置20 min。实验分为4个组:对照组(control siRNA 转染且未加药物刺激组)、转染组(p27 siRNA转染且未加药物刺激组)、药物处理组(control siRNA 转染后予以10 μmol/L T0901317刺激48 h)和干扰组(p27 siRNA转染后予以T0901317刺激48 h)。转染步骤:用1.5 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基进行细胞换液,再将脂质体混合液体系或寡核苷酸片段混合液转染体系加入6 孔细胞培养板中,轻轻混匀,转染4~8 h 后弃去孔内液体,更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养24 h,根据分组加入相应试剂转染48 h,收集细胞用于CCK-8法检测。
2 结果
2.1 CCK-8法检测细胞活力 以0 μmol/L(control组)细胞活力(100%)相比,1、5和10 μmol/L药物处理后的细胞存活率分别为(98.54±0.94)%、(87.03±0.93)%和(75.57±1.85)%,差异有统计学意义(F=301.90,P<0.01)。组间两两比较结果表明,与control组相比,1 μmol/L组细胞活力差异无统计学意义(q=2.21,P>0.05),而5和10 μmol/L组差异均有统计学意义(q分别为19.77和37.24,P均<0.01)。
2.2 流式细胞术检测细胞周期 control组、1、5和10 μmol/L组间G1期细胞比例差异有统计学意义(F=80.83,P<0.01),4组间S期细胞比例差异亦有统计学意义(F=221.30,P<0.01)。见表1。
表1 流式细胞术检测的细胞周期结果
注:与G1期control组相比,*,P<0.01;与S期control组相比,#,P<0.01。
2.3 实时定量PCR检测p27和Skp2 mRNA的表达水平 与control组相比,10 μmol/L T0901317处理组的p27 mRNA表达水平为0.99±0.02,差异无统计学意义(t=0.28,P>0.05),而Skp2 mRNA表达水平为(0.52±0.02),差异有统计学意义(t=29.22,P<0.01)。
2.4 实时定量PCR法检测p27小干扰片段的干扰效率 与对照组(control siRNA)相比,p27 siRNA转染组的p27的表达水平(0.40±0.02)明显下调,差异具有统计学意义(t=52.38,P<0.01)。
2.5 western blot检测p27和Skp2蛋白的表达 与control组(p27蛋白相对灰度值为2.28±0.10,Skp2蛋白为1.89±0.01)相比,T0901317处理组p27蛋白相对灰度值为2.84±0.14,Skp2蛋白相对灰度值为0.98±0.12,差异均有统计学意义(t=4.54,P<0.05,t=10.98,P<0.01)。见图1。
图1 western blot检测p27蛋白、Skp2蛋白的表达
2.6 CCK-8法检测p27干扰后胰岛β细胞活力的变化 以对照组(100%)为参照,转染组、药物处理组和干扰组的细胞存活率分别为(100.97±1.08)%、(75.03±1.83)%和(86.67±2.45)%。与对照组比较,转染组差异无统计学意义(t=1.542,P>0.05),但药物处理组细胞活力下降(t=23.58,P<0.01)。此外,药物处理组和干扰组间差异亦有统计学意义(t=7.77,P<0.01)。
3 讨论
本研究从LXR激动剂对胰岛β细胞增殖的作用方面探讨LXR异常激活与糖尿病的关系,结果发现,LXR的异常激活并未引起胰岛β细胞明显的凋亡,却导致细胞G1/S周期阻滞。推测原因可能为在2型糖尿病发生、发展过程中,不断升高的血糖、血脂作为LXR内源性的激动剂,持续激活LXR,导致胰岛β细胞增殖抑制,胰岛β细胞逐渐失代偿性减少,导致细胞功能衰竭,最终发展为糖尿病。
G1/S期是细胞周期的主要限制点。正向调控因子—细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-CDK)可促进细胞通过调定点,而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKI)通过抑制CDK阻断细胞周期的进程,负向调控细胞周期。p27蛋白是CDKI的重要成员,通过抑制cyclin-CDK阻滞细胞周期,进而阻止肿瘤形成。本研究结果显示,LXR异常激活可以诱导p27蛋白质水平增高。为了进一步验证p27在LXR介导的胰岛β细胞周期阻滞中的作用,我们合成了p27的干扰片段。通过细胞活力分析结果表明,转染组与对照组间差异并无统计学意义,说明在没有药物处理的情况下,p27 siRNA对细胞活力并无影响。LXR异常激活抑制胰岛β细胞增殖,T0901317药物处理组相较于对照组细胞活力下降。而药物处理组和干扰组间差异亦有统计学意义,说明干扰p27的表达后再予以药物刺激,胰岛β细胞的活力得到部分的恢复。提示p27在LXR介导的G1/S周期阻滞中起了重要作用。但T0901317处理并未改变p27 mRNA水平,推测其可能是通过转录后作用而非转录作用增加p27蛋白的表达量。
Skp2作为泛素化-蛋白酶体系统成员,与细胞周期调控及肿瘤的发生、发展和预后密切相关[3-4]。Skp2可作为人胃癌的原癌基因,抑制Skp2的表达并可上调p27的水平,从而抑制胃癌细胞的增殖和肿瘤形成[3]。另有研究表明,苦参碱提取物YF-18通过下调Skp2水平,上调p27的表达诱导细胞G2/M周期阻滞,抑制细胞增殖和迁移[5]。本研究检测了在p27转录后修饰中起重要作用的Skp2的表达水平。结果显示T0901317 可同时下调Skp2 mRNA和蛋白质水平,提示Skp2可能是LXR诱导的p27蛋白表达水平上调的关键分子。但LXR调控Skp2影响p27水平的具体分子生物学机制尚不明确,尚待后续深入研究。
[1]Rough JJ, Monroy MA, Yerrum S,etal. Anti-proliferative effect of LXR agonist T0901317 in ovarian carcinoma cells[J]. J Ovarian Res, 2010,3:13.
[2]Chuu CP, Lin HP.Antiproliferative effect of LXR agonists T0901317 and 22(R)-hydroxycholesterol on multiple human cancer cell lines[J]. Anticancer Res,2010,30(9):3643-3648.
[3]Wen Y, Wang K, Yang K. Inhibiting the role of Skp2 suppresses cell proliferation and tumorigenesis of human gastric cancer cells via the upregulation of p27kip1[J]. Mol Med Rep,2016,14(4):3917-3924.
[4]陆建明,陆建新,沈爱国,等. Skp2和p27kip1蛋白在B细胞性非霍奇金淋巴瘤中的表达、定位及意义[J].临床检验杂志,2008,26(3):167-169.
[5]Wu L, Wang G, Wei J,etal. Matrine derivative YF-18 inhibits lung cancer cell proliferation and migration through down-regulating Skp2[J]. Oncotarget,2017,8(7):11729-11738.
(本文编辑:许晓蒙)
Activation of liver X receptors induced pancreatic β cell cycle arrest by up-regulating the expression of p27 protein
MAOXu-hua1,TANGJun-ming1,QIAOGuo-hong1,FENGSi-yi1,HANXiao2,JINGChang-wen3
(1.DepartmentofClinicalLaboratory,YixingPeople′sHospital,Yixing214200,Jiangsu; 2.HumanFunctionalGenomicsLaboratory,NanjingMedicalUniversity,Nanjing211166,Jiangsu; 3.ClinicalCancerResearchCenter,CancerInstituteofJiangsuProvince,CancerHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,Jiangsu,China)
Objective To investigate the effects of liver X receptor (LXR) agonist on the proliferation of mouse pancreatic β cell line MIN6 cells. Methods The viability, changes of cell cycle, mRNA levels of S phase kinase associated protein 2 (Skp2) and p27, and protein levels of Skp2 and p27 in MIN6 cells treated with LXR agonist T0901317 were determined by the CCK-8 method, flow cytometry, real-time RT-PCR and western blot, respectively. Results The viability of MIN6 cells treated with 1 μmol/L, 5 μmol/L and 10 μmol/L of T0901317 were (98.54±0.94)%, (87.03±0.93)% and (75.57±1.85)% of the controls, respectively, and there was significant difference among them (F=301.90,P<0.01). The percentages of G1phase cells in the MIN6 cells treated with 0 μmol/L, 1 μmol/L, 5 μmol/L and 10 μmol/L of T0901317 were (35.93±2.25)%, (38.45±0.91)%, (45.46±1.34)% and (53.28±1.14)%, respectively, and there was significant difference among them (F=80.83,P<0.01). Similarly, the percentages of S phase cells in the MIN6 cells treated with 0 μmol/L, 1 μmol/L, 5 μmol/L and 10 μmol/L of T0901317 were (52.87±1.19)%, (48.65±0.85)%, (36.31±1.37)% and (31.45±1.22)%, respectively, and there was also significant difference among them (F=221.30,P<0.01). The protein levels of p27 in the MIN6 cells treated with 10 μmol/L of T0901317 (2.84±0.14) were significantly higher than that in the controls (2.28±0.10) (t=4.54,P<0.05), while there was no significant difference in the mRNA levels of p27 between them (t=0.28,P>0.05). However, 10 μmol/L of T0901317 significantly decreased mRNA (0.52±0.02,t=29.22,P<0.01) and protein levels (0.98±0.12 vs 1.89±0.01,t=10.98,P<0.01) of Skp2 in MIN6 cells. Based on the control siRNA transfection group as a reference (100%), the cell survival rates of the p27 siRNA transfection group, 10 μmol/L of T0901317 treatment group and the intervention group (p27 siRNA transfection+T0901317 treatment) were (100.97±1.08)%, (75.03±1.83)% and (86.67±2.45)%, respectively. There was no significant difference between the control siRNA and p27 siRNA transfection groups (t=1.542,P>0.05). Compared with the control siRNA transfection group, the cell survival rates of the T0901317 treatment group decreased (t=23.58,P<0.01). There was also significant difference in the cell survival rates between the T0901317 treatment group and the intervention group (t=7.77,P<0.01). Conclusion The activation of LXR may induce pancreatic β cell cycle arrest by up-regulating the expression of p27 and down-regulating the expression of Skp2.
type 2 diabetes; liver X receptor agonist; p27; S phase kinase associated protein 2; cell cycle arrest
10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.18
江苏省卫生计生委科研项目(Z201602)。
毛旭华,1985年生,男,主管技师,硕士,主要从事医学检验与分子生物学研究。
井昶雯,助理研究员,E-mail:jcw223200@163.com。
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A
2017-02-28)