制固态曲参数对酱油曲中Aspergillus oryzae NCFEC03产蛋白酶活力的影响

梁晋维，李斌，俞东阳，万茵，刘成梅,3，付桂明,3*

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌 330047；2.南昌大学 食品学院，南昌 330031；3.南昌大学中德食品工程中心，南昌 330047)

制固态曲参数对酱油曲中Aspergillus oryzae NCFEC03产蛋白酶活力的影响

梁晋维1,2，李斌1,2，俞东阳1,2，万茵1,2，刘成梅1,2,3，付桂明1,2,3*

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌 330047；2.南昌大学 食品学院，南昌 330031；3.南昌大学中德食品工程中心，南昌 330047)

以5种米曲霉为出发菌株，筛选获得产蛋白酶活力最强的米曲霉AspergillusoryzaeNCFEC03，通过单因素试验研究麸皮豆粕比、加水量、接种量、时间和培养温度等酱油固态制曲因素对AspergillusoryzaeNCFEC03产蛋白酶的影响。选取影响较大的3个因素：麸皮豆粕比、加水量和接种量进行正交试验。经极差和方差分析发现，对酱油曲中蛋白酶活力影响的先后顺序为：麸皮豆粕比>加水量>接种量，其中麸皮豆粕比具有最显著的影响。最佳制曲条件为麸皮豆粕比1∶1、加水量80%(V/W，干曲)、接种量0.8%、30 ℃条件下培养48 h，米曲霉AspergillusoryzaeNCFEC03产蛋白酶活力为(1687.6±4.9) U/g干曲。

酱油；固态制曲参数；米曲霉AspergillusoryzaeNCFEC03；蛋白酶活力

我国是世界酱油产量大国。酱油是一种以大豆、小麦和食盐等原料经微生物发酵酿制而成的色、香、味俱备的调味品[1]。酱油酿造涉及的微生物主要有米曲霉(Aspergillusoryzae)、酱油曲霉(Aspergillussojae)、酵母菌(Saccharomyces)和乳酸菌(Lactobacillus)等，其中米曲霉具有生长快、产酶能力强、酶活力高等特点，是酱油酿造的基础和核心菌种[2-4]。米曲霉能分泌多种酶系，包括蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和酯酶等[5]，其制曲酿制的酱油香气好。目前我国酱油酿造常用的米曲霉菌株有：Aspergillusoryzae3.863、沪酿3.042、UE336、UE328和渝3.811等，其中最常用的沪酿3.042来源于福建省永春县酱园，经上海酿造科学研究所诱变选育获得[6]。

酱油的发酵是酱油曲中微生物代谢的一系列复杂的酶水解及美拉德反应的过程。酱油曲中主要的酶包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和谷氨酸脱氢酶等，其中蛋白酶活性的高低决定了酱油中可溶性含氮物的含量、风味形成。研究表明：利用米曲霉所产蛋白酶的水解作用，将豆类中的蛋白质降解成多肽、氨基酸，发酵酱油口味好、营养丰富。

酱油酿造过程中原料比、发酵温度、含水量等发酵工艺参数均对米曲霉产蛋白酶活力有较大影响[7,8]。因此，研究酱油固态酿造中制曲条件对米曲霉产蛋白酶活力的影响，对提高酱油质量和原料利用率具有重要意义[9]。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

5种米曲霉菌株：AspergillusoryzaeNCFEC01～AspergillusoryzaeNCFEC05，来自实验室保藏。土豆、麸皮、豆粕，均为市售；L-酪氨酸、酪蛋白，购自Sigma公司；NaCl、Na2CO3、福林试剂、三氯乙酸、硫酸等，均为国产分析纯。

1.2 培养基

1.2.1 PDA培养基

取200 g去皮去芽眼的马铃薯，切成细条，加入500 mL水，小火煮沸30 min后2层纱布过滤，马铃薯条用200 mL水再洗1次，过滤，混合2次滤液，加入蔗糖20 g、琼脂20 g，定容至1 L，121 ℃灭菌20 min。

1.2.2 种曲培养基

在250 mL三角瓶中加入20 g过10目筛的麸皮豆粕混合物(麸皮∶豆粕为1∶1)，加入70%(V/W，干基)的水拌匀，121 ℃灭菌20 min。

1.2.3 制曲培养基

取50 g不同比例麸皮豆粕混合物，加入500 mL三角瓶中，加入80%(V/W，干基)的水拌匀，121 ℃灭菌20 min。

1.3 仪器

T6新世纪型号紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；FE28型酸度计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HWS-250型恒温恒湿培养箱 上海森信实验仪器有限公司；LDZX-50KB型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；JA5003型电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；TGL-16B型高速离心机 上海安亭科学仪器厂；SCV-4A1型超净工作台 厦门精艺兴业科技有限公司；PH50型生物显微镜 江西凤凰光学集团有限公司。

2 实验方法

2.1 蛋白酶活性的测定

采用Folin-酚法测定蛋白酶活性[10]：取5 g曲样研磨成粉状，用100 mL蒸馏水于40 ℃浸提1 h得粗酶液，取1 mL粗酶液于10 mL试管中，40 ℃预热2 min，加预热的2%酪蛋白溶液1 mL，保温10 min，加2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸终止反应，40 ℃继续保温20 min，离心去除蛋白沉淀，取1 mL上清液于试管中，加5 mL 0.4 mol/L的Na2CO3和1 mL福林试剂，摇匀，40 ℃水浴中保温20 min，取出测OD660。空白样加2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸，保温10 min，加预热的2%酪蛋白溶液1 mL。

将40 ℃下每1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需的酶量定义为1个单位蛋白酶活力(U)。

2.2 高产蛋白酶米曲霉菌株的筛选

以PDA培养基进行菌株活化米曲霉菌种，取20 g种曲培养基，接种各株米曲霉，于30 ℃培养72 h，采用Folin-酚法测定蛋白酶活力，选取产蛋白酶活力高的菌株。

制曲工艺流程：

取一定量种曲到定量生理盐水中，震荡摇匀后，均匀加入曲料，30 ℃左右恒温培养一定时间，当曲料表面着生黄绿色孢子，并散发曲香时出曲[11]，获得无酸味、氨味等不良异味的成品曲。

2.4 单因素试验

通过单因素试验研究麸皮豆粕比、加水量、接种量、时间和培养温度等不同条件对酱油制曲过程中蛋白酶的影响。单因素试验的基本参数设定为：麸皮豆粕比例1∶1、加水量85%(V/W，干基)、接种量0.4%、30 ℃下培养48 h，以曲块中蛋白酶活力为判断依据，选取最优单因素条件，每确定一项最优条件后，以得出的最优条件替换原有参数进行下一个试验。

2.5 三因素三水平正交试验

在单因素试验基础上，选取对米曲霉产蛋白酶活力影响较大的3个因素，设计L9(33)正交试验，以曲块中蛋白酶活力为指标，研究对米曲霉产蛋白酶活力影响显著的因素。

3 结果与分析

3.1 酪氨酸标准曲线

绘制酪氨酸标准曲线(见图1)，用以菌株产蛋白酶活力的测量，标准曲线的线性回归方程为y=2.1143x+0.0164，R2=0.9934。

图1 酪氨酸标准曲线

3.2 各米曲霉菌株产蛋白酶活力比较

2.3 不同分期的宫颈癌组织中Ki-67、p16及p53表达情况的比较 16例宫颈癌患者中，Ⅰ期10例，Ⅱ期6例。宫颈癌Ⅰ期与Ⅱ期患者Ki-67、p16及p53表达阳性率的比较，存在明显差异(P<0.05)。见表3。

图2 各米曲霉菌株产蛋白酶活力

由图2可知，在相同实验条件下培养的不同米曲霉菌株产蛋白酶活力相差较大，其中AspergillusoryzaeNCFEC03菌株产蛋白酶活力最高，可达(1603.6±8.2) U/g，AspergillusoryzaeNCFEC01菌株所产蛋白酶活力最低，仅为(824.2±6.1) U/g。选取AspergillusoryzaeNCFEC03进行制曲条件优化。

3.3 麸皮豆粕比对成品曲米曲霉产蛋白酶活力的影响

图3 麸皮豆粕比对Aspergillus oryzae NCFEC03产蛋白酶活力的影响

由图3可知，培养基中麸皮、豆粕用量为1∶1时，所制曲蛋白酶活力最高，为(1427.8±7.6) U/g。培养基中豆粕含量高可促进蛋白酶的分泌，但过高比例豆粕的曲块的蛋白酶酶活降低，主要原因是曲料结构紧密，阻碍了氧气进入曲块内部和抑制了菌丝生长。制曲时添加适量的麸皮，可以使曲块疏松并提供碳源，能促进米曲霉菌丝的粗壮、浓厚生长[12]，但过高比例的麦麸使菌丝体生长过旺，蛋白酶产量反而降低。

3.4 不同培养时间对成品曲米曲霉产蛋白酶活力的影响

图4 发酵时间对Aspergillus oryzae NCFEC03产蛋白酶活力的影响

接种后米曲霉菌丝大量繁殖，由图4可知，制曲12 h时，产蛋白酶活力仍然较低，24 h后分生孢子开始着生，产酶量显著增大，到48 h达高峰期；制曲48 h后，米曲霉产蛋白酶活力开始下降，这与米曲霉的生长曲线相似，蛋白酶为初级代谢产物，与菌体生长过程同步。

不同发酵时间的曲块感官和产蛋白酶情况见表1。

表1 不同发酵时间的曲块感官和产蛋白酶情况

3.5 培养温度对米曲霉产蛋白酶活力的影响

图5 培养温度对Aspergillus oryzae NCFEC03产蛋白酶活力的影响

米曲霉菌丝繁殖的最适温度为30～35 ℃，产酶的最适温度为(30±2) ℃。由图5可知，30 ℃为AspergillusoryzaeNCFEC03的最适产蛋白酶温度，蛋白酶活力最高为(1426.7±4.5) U/g。温度过低，菌株生长速度较慢，影响米曲霉菌丝生长和产孢子数，使蛋白酶产量降低；而温度过高，米曲霉产孢子数减少，导致酶活力下降[13]。

3.6 不同加水量对成品曲米曲霉产蛋白酶活力的影响

图6 加水量对Aspergillus oryzae NCFEC03产蛋白酶活力的影响

由图6可知，水分含量过高或过低对AspergillusoryzaeNCFEC03蛋白酶活力都有影响。在加入低水分(干料量70%)时，种曲培养基中营养物质的溶解量下降，影响菌丝的生长，产蛋白酶活力较低，仅为(980.8±4.7) U/g。水分适当(80%)时，米曲霉AspergillusoryzaeNCFEC03生长旺盛，产蛋白酶活力最高可达(1569.5±3.7) U/g。之后，随着加水量增加，蛋白酶活力逐渐降低。原因可能是高水分使种曲培养基多孔性降低、黏度增加、透气性下降，使好氧的米曲霉生长受到抑制，产蛋白酶量也随之下降[14]。

3.7 不同种曲接种量对成品曲米曲霉产蛋白酶活力的影响

图7 种曲接种量对Aspergillus oryzae NCFEC03产蛋白酶活力的影响

由图7可知，AspergillusoryzaeNCFEC03产蛋白酶活力随种曲接种量增加而增大，菌丝的生长也越旺盛，接种量为0.6%时达到峰值，为(1628.3±3.6) U/g，但接种量过大，会引起供氧不足，营养物质消耗过快，影响米曲霉孢子成熟，导致产酶量降低。

由单因素试验结果可知，AspergillusoryzaeNCFEC03产蛋白酶的最优条件为：麸皮豆粕比1∶1，加入80%(V/W，干料量)的水，接种量0.6%，培养温度30 ℃，培养时间48 h。

3.8 正交试验结果

根据单因素试验结果，设计L9(33)正交试验，固定发酵时间48 h、培养温度30 ℃，选取对米曲霉产蛋白酶活力影响较大的3个因素(加水量、接种量、麸皮豆粕比)，研究它们对米曲霉产蛋白酶活力影响的显著性。 正交试验因素水平表见表2，正交试验结果见表3，方差分析表见表4。

表2 因素水平表

表3 正交试验结果

表4 方差分析表

注：“*”表示影响显著。

经极差和方差分析，固态酿造酱油制曲过程中，对AspergillusoryzaeNCFEC03产蛋白酶活力的影响顺序为：麸皮豆粕比>加水量>接种量。其中加水量和接种量在试验所选范围内没有显著性影响，麸皮豆粕比具有显著性影响。培养基中豆粕主要提供氮源——蛋白质，可促进米曲霉快速生长、产蛋白酶，但过高豆粕比例的曲，结构紧密，不利于氧气的进入，会抑制米曲霉生长产酶。麦麸提供碳源——碳水化合物和疏松作用的纤维。适量比例的麸皮，可使曲块疏松并提供碳源，促进米曲霉菌丝生长、分泌蛋白酶，但麦麸比例过高，培养基蛋白质含量降低，使菌体产蛋白酶能力下降。根据单因素和正交优化结果，麸皮豆粕比例1∶1为最佳。

4 结论

通过L9(33)正交优化的固态制曲最优条件为：麸皮豆粕比1∶1、加水量80%(V/W)、接种量0.8%、30 ℃培养48 h、米曲霉Aspergillusoryzae

NCFEC03产蛋白酶活力(1687.6±4.9)U/g干曲，是一株产蛋白酶能力强的菌株，下一步以其为酱油发酵菌种进行酿造工艺研究，可为其工业化菌株提供研究基础。

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Effect of Solid-state Fermentation Parameters on Protease Activity ofAspergillusoryzaeNCFEC03 in Soy Sauce Koji

LIANG Jin-wei1,2, LI Bin1,2, YU Dong-yang1,2, WAN Yin1,2, LIU Cheng-mei1,2,3, FU Gui-ming1,2,3*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2.School of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330031, China; 3.Sino-German Food Engineering Center, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

AspergillusoryzaeNCFEC03 with the strongest protease activity is selected from fiveAspergillusoryzaestrains. Single factor experiment is used to research the effect of solid-state soy sauce koji fermentation parameters such as ratio of bran and soybean meal,additive amount of water, inoculum dose, culture time and culture temperature on protease production ofAspergillusoryzaeNCFEC03, and then the three main factors such as the ratio of bran and soybean meal, the additive amount of water and the inoculum dose are selected for orthogonal experiment. With range and variance analysis, it is found that the sequence of influence factors for protease activity in soy sauce koji is: the ratio of bran and soybean meal>the additive amount of water>the inoculum dose, and the ratio of bran and soybean meal is the most significant factor affecting protease activity. The optimum koji-making conditions are as follows: the ratio of bran and soybean meal is 1∶1, the additive amount of water is 80% (dry koji), the inoculum dose is 0.8%, being fermented at 30 ℃ for 48 h, and the protease activity is (1687.6±4.9) U/g dry koji.

soy sauce;solid-state fermentation parameters;AspergillusoryzaeNCFEC03;protease activity

2016-12-14 *通讯作者

国家自然科学基金资助(31169336)

付桂明(1972-)，男，教授，博士，研究方向：食品科学、发酵工程。

TS201.25

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.06.006

1000-9973(2017)06-0029-05