食用醋中乙酰磺胺酸钾测定的探讨和改进

刘超，景赞，黄志勇

(乐山食品药品检验检测中心，四川 乐山 614000)

食用醋中乙酰磺胺酸钾测定的探讨和改进

刘超，景赞，黄志勇

(乐山食品药品检验检测中心，四川 乐山 614000)

改进了食用醋中乙酰磺胺酸钾的检测方法。建立了以ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×100 mm，3.5 mm)为液相色谱柱；以甲醇、10 mmol/L乙酸铵(pH为4.0)为流动相；检测波长为214 nm；流速为1.0 mL/min的检测方法，讨论了滤出液体积的选择、洗脱液体积的选择。结果表明：乙酰磺胺酸钾在0～8.0 μg/mL内具有良好的线性关系，检出限为1.42 μg/mL，加标回收率在92.1%～97.5%。与国标方法相比较，提高了方法的灵敏度、准确度及精密度。

食用醋；乙酰磺胺酸钾；高效液相色谱法

乙酰磺胺酸钾化学名称为6-甲基-1,2,3-氧恶嗪-4-(3H)-酮-2,2-二氧钾盐；6-甲基-2,2-二氧代-1,2,3-氧硫氮杂；6-甲基-1,2,3-氧恶嗪-4-(3H)-酮-2,2-二氧钾盐，又称为安赛蜜、A-K糖，1983年首次在英国得到批准[1]，甜度为蔗糖的200倍[2]，安赛蜜对光、热(能耐225 ℃高温)、pH值适用范围较广，是目前稳定性最好的甜味剂之一，其生产工艺不复杂、价格便宜、性能优于阿斯巴甜，被认为是最有前途的甜味剂之一，我国规定安赛蜜可用于饮料、冰淇淋、糕点、蜜饯、焙烤食品等[3]。

目前我国发布的检测方法仅有GB/T 5009.140-2003《饮料中乙酰磺胺酸钾的测定》，此检测方法在一定程度上解决了乙酰磺胺酸钾的测定，但是GB/T 5009.140-2003《饮料中乙酰磺胺酸钾的测定》[4]中使用中性氧化铝层析柱，势必在检测结果的准确度、精密度和检测效率上有一定的影响；为此本文采取市售的中性氧化铝柱代替中性氧化铝层析柱，且优化了前处理过程，取得了良好效果。本文改进了食醋中安赛蜜的检测方法，在国内尚属首次。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水：GB/T 6682规定的一级水；乙酰磺胺酸钾标准品(0.25 g，99.0%，Lot：40409 04/2018 Dr.Ehrenstorfer GmbH，06/2018)；中性氧化铝柱(1000 mg/3 mL)。

1.2 仪器与设备

DGU-20A高效液相色谱仪(配有紫外检测器) 日本岛津公司；CP225D分析天平(精确度0.01 mg) 德国赛多利斯集团；ASE-12固相萃取仪；TD420高速离心机 四川蜀科仪器有限公司；微孔滤膜(水相，0.22 μm)。

1.3 标准溶液的制备

1.3.1 乙酰磺胺酸钾标准储备液

称取0.01 g乙酰磺胺酸钾标准品，加一级水溶解并定容至50 mL，此溶液浓度为200 μg/mL。

1.3.2 乙酰磺胺酸钾标准中间液

准确移取2.5 mL乙酰磺胺酸钾标准储备液，用一级水稀释并定容至50 mL，此溶液浓度为10 μg/mL。

1.3.3 乙酰磺胺酸钾标准工作溶液

根据需要将乙酰磺胺酸钾标准中间液，用一级水稀释成浓度为0,1.0,2.0,3.0,4.0,8.0 μg/mL的标准工作溶液。

1.4 试样的提取

吸取2.5 mL食用醋试样置于10 mL离心管中，加水定容至刻度，混匀后于4000 r/min离心10 min，上清液全部转移至中性氧化铝柱中，收集全部滤出液，用10 mL流动相(1+1)洗脱，收集全部洗脱液，合并滤出液和洗脱液，用水定容至25 mL容量瓶中，过0.45 μm滤膜，供液相色谱仪测定。

1.5 色谱条件

1.5.1 液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×100 mm，3.5 mm)，进样体积：10 μL，流速：1.0 mL/min， 柱温：40 ℃，检测波长：214 nm，流动相：A(10 mmol/L 乙酸铵，pH为4)，B甲醇。流动相条件见表1。

表1 流动相条件

1.5.2 色谱分析

由自动进样器吸取净化后的样品溶液10 μL，注入色谱仪中，以保留时间定性，以外标法定量。

2 结果讨论

2.1 滤出液体积的选择

试验中采用接收滤出液体积分别为：全部接收，接收5 mL，接收0 mL进行加标回收试验，见图1。

图1 不同接收液体积对应的回收率

由图1可知，当全部接收滤出液时，回收率最高，为94.8%；当接收滤出液为5 mL左右时，回收率为56%；当接收体积为0 mL时，回收率为27.6%。本试验采用全部接收滤出液体积。可能的原因是试样中的乙酰磺胺酸钾经过中性氧化铝柱，除少部分残留在小柱上，其余全部流出，而干扰物则全部留在中性氧化铝柱上。

2.2 洗脱液体积的选择

吸取2.5 mL食用醋试样置于10 mL离心管中，加水定容至刻度，混匀后于4000 r/min离心10 min，上清液全部转移至中性氧化铝柱中，收集全部滤出液，试验中采用洗脱液体积分别为0，3，5，10，15 mL流动相洗脱，做加标回收试验，结果见图2。

图2 不同洗脱体积对应的回收率

由图2可知，0 mL洗脱液时，回收率为83.5%；3 mL，洗脱液时，回收率为89.4%；5 mL洗脱液时，回收率为92.9%；10 mL洗脱液时，回收率为98.8%；15 mL，洗脱液时，回收率为98.5%。由此可见，当洗脱体积为10 mL时，已可完全将乙酰磺胺酸钾洗脱下来。从节约试剂的角度出发，洗脱体积选择 10 mL流动相。

2.3 流动相的选择

不同实验室配备的设备型号不同，因此只有摸索出适合本实验室最佳色谱条件才能保证最佳的分析效果。同时比较了GB/T 5009.140-2003中流动相和A：10 mmol/L乙酸铵(pH为4)，B：甲醇作为流动相，从峰型、灵敏度、配制流动相的方便性和经济性、节约试剂等方面考虑，最终选择10 mmol/L乙酸铵(pH为4)，B：乙腈梯度洗脱为本试验的流动相，这与20 mmol/L乙酸铵溶液-甲醇(体积比95∶5)文献报道相吻合[5]。

图3 0.02 mol/L硫酸铵、甲醇、乙腈、10% H2SO4作为流动相对应的安赛蜜图谱

图4 10 mmol/L乙酸铵(pH为4)、甲醇作为流动相对应的安赛蜜图谱

2.4 中性氧化铝的选择

分别吸取2.5 mL食用醋试样置于2支10 mL离心管中，加水定容至刻度，混匀后于4000 r/min离心10 min，一支离心管中上清液全部转移至中性氧化铝柱中，收集全部滤出液，用10 mL流动相(1+1)洗脱，收集全部洗脱液，合并滤出液和洗脱液，用水定容至25 mL容量瓶中，过0.45 μm滤膜，供液相色谱仪测定；另一离心管中上清液直接过0.45 μm滤膜，供液相色谱仪测定。未过中性氧化铝柱的试样同时进液相色谱串联质谱仪，测其含量,见图5。

图5 食醋中不同试验过程对应的安赛蜜含量

由图5可知，未过中性氧化铝柱的试样出现假阳性，可能的原因是食醋中成分复杂，对目标物安赛蜜产生干扰，这与尹峰等[6]的研究结果相同。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性范围的确认

标准曲线：以峰面积为纵坐标，以对照品溶液浓度为横坐标，得标准曲线回归方程，见表2。

表2 乙酰磺胺酸钾标准曲线回归方程

由表2可知，以进样浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，回归方程y=36753x-156.9，r=0.9999，试验表明：乙酰磺胺酸钾在0～8 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.5.2 方法检出限的确认

由自动进样器吸取0.3 μg/mL的标准工作溶液10 μL，注入色谱仪中，平行进样3次，求信噪比的平均值。

进样量：3 ng，信噪比：65.8，63.2， 61.8。

仪器检出限：3×3 ng /65.8=0.137 ng，3×3 ng /63.2=0.142 ng，3×3 ng/61.8=0.146 ng。

仪器检出限平均值：(0.137 ng+0.142 ng+0.146 ng)/3=0.142 ng。

方法检出限：0.142 ng ×25 mL /10 μL×2.5 mL=1.42 μg/mL。

结果表明：根据S/N=3,计算出该方法检出限为1.42 μg/mL。由此可见，该方法检出限低于GB/T 5009.140-2003的方法检出限，即灵敏度高于GB/T 5009.140-2003。

2.5.3 加标回收率的确认

将乙酰磺胺酸钾储备液稀释至10 μg/mL，准确吸取9份混匀的试样各2.5 mL(精确至0.01 g)食用醋试样置于10 mL离心管中，分别准确移取0.05，0.3，0.6 mL上述乙酰磺胺酸钾溶液各3～9份于试样中，加水定容至刻度，混匀后于4000 r/min离心10 min，上清液全部转移至中性氧化铝柱中，收集全部滤出液，用10 mL流动相(1+1)洗脱，收集全部洗脱液，合并滤出液和洗脱液，用水定容至25 mL容量瓶中，过0.45 μm滤膜，供液相色谱仪测定。

式中：C1为测得的加标样品中乙酰磺胺酸钾的浓度，ng/mL;C2为测得的空白基质样品中乙酰磺胺酸钾的浓度，ng/mL;M为加标质量，ng。

表3 乙酰磺胺酸钾加标回收率

结果表明：该方法回收率为92.1%～97.5%，符合GB/T 27404-2008[7]《实验室质量控制规范 食品理化检测》中的规定(70%～120%)，即该方法准确度良好。

2.5.4 精密度的确认

乙酰磺胺酸钾中间液稀释成0.8 μg/mL标准溶液，由自动进样器吸取净化后的样品溶液10 μL，注入色谱仪中，记录色谱图，测定峰面积，计算出RSD值，见表4。

表4 乙酰磺胺酸钾精密度

3 结论

本文改进了食用醋中乙酰磺胺酸钾的检测方法。优化了前处理过程，考察了滤出液体积、洗脱液体积、流动相的选择及是否选择使用中性氧化铝柱对结果的影响。从线性范围、方法检出限、加标回收、精密度等方面进行方法学的考察，结果本法与国标方法相比较，提高了方法检出限、准确度及精密度。因此，所建立方法能够满足实际检测的需要。

[1]卢丽明，黄诚，周日东.饮料中乙酰磺胺酸钾的高效液相色谱测定法[J].职业与健康,2008,24(15)：1520-1521.

[2]关瑾.甜味剂的应用现状及发展前景[J].当代化工,2002,31(2)：89-91.

[3]GB 2760-2014，食品添加剂使用标准[S].

[4]GB/T 5009.140-2003，饮料中乙酰磺胺酸钾的测定[S].

[5]郭友珍，王志宏.同时测定碳酸饮料中苯甲酸钠、山梨酸钾和安赛蜜的高效液相色谱法[J].分析测试学报,2001,20(4)：67-68.

[6]尹峰，丁召伟，曹雪，等.固相萃取-高效液相色谱/串联质谱法测定食醋中的3种甜味剂[J].色谱,2011,29(6)：554-557.

[7]GB/T 27404-2008，实验室质量控制规范 食品理化检测[S].

Discussion and Improvement on Determination of Acesulfame Potassium in Vinegar

LIU Chao，JING Zan，HUANG Zhi-yong

(Leshan Food and Drug Inspection and Testing Center，Leshan 614000，China)

The detection method of acesulfame potassium in vinegar is improved. The method is developed based on ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×100 mm,3.5 mm) liquid chromatographic column;take methyl alcohol and 10 mmol/L ammonium acetate (pH 4.0) as mobile phase; detection wavelength at 214 nm;flow rate at 1.0 mL/min. The results show that it has a good linear when acesulfame potassium is in the range of 0～8.0 μg/mL,and the detection limit is 1.42 μg/mL,the adding standard recovery rate is 92.1%～97.5%. Compared with the national standard method,the sensitivity,accuracy and precision of the method is improved.

vinegar; acesulfame potassium; HPLC

2017-01-08

刘超(1984-)，男，工程师，硕士，研究方向：食品安全。

TS264.22

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.06.031

1000-9973(2017)06-0142-04