富含单不饱和脂肪酸饮食对非酒精性脂肪性肝炎大鼠胰岛素敏感性的影响

李楠 徐正婕 段晓燕 郑培奋

富含单不饱和脂肪酸饮食对非酒精性脂肪性肝炎大鼠胰岛素敏感性的影响

李楠 徐正婕 段晓燕 郑培奋

目的 通过观察富含单不饱和脂肪酸（MUFA）和富含饱和脂肪酸（SFA）髙脂饮食（HFD）诱导的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）大鼠血清和 TNF- α、IL-6、瘦素（LP）和脂联素（APN）水平的变化，探讨 MUFA 对 NASH 大鼠胰岛素敏感性的影响及可能的分子机制。 方法 随机将 30 只雄性 SD 大鼠分为 3 组，分别予正常饲料（C 组）、富含 MUFA 的橄榄油（M 组）和富含 SFA 的猪油（S组）成分的高脂饲料喂养 12 周，测定体重、肝脏脂质含量、血清转氨酶、血脂、空腹血糖（FBG）和胰岛素（INS）水平，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），光镜下观察肝组织病理并计算 NAFLD 活动度积分（NAS），应用 Western-blot半定量胰岛素受体底物 -1（IRS-1）蛋白表达，ELISA 法检测血清和肝脏 TNF- α、IL-6、LP 及 APN 水平。 结果 高脂饮食 12 周成功建立大鼠 NASH 模型。与 S 组相比，M 组体重增长较少（P＜0.05），肝脏 TG 含量减少（P＜0.05），HOMA-IR 和 NAS 均下降（P＜0.05），肝脏 IRS-1 蛋白表达上调约 60%（P＜0.05）。与 C 组比较，S 组血清 LP、TNF- α 水平升高，且高于 M 组（P＜0.05），血清和肝脏 APN 水平均下降（P＜0.05），但肝脏APN 水平与 M 组差异无统计学意义（P ＞0.05）。 结论 长期过量摄入等热量 MUFA 和 SFA 均可诱发胰岛素抵抗（IR），导致 NASH发生。MUFA 对血糖、血脂、肝脂肪含量及 IR 程度的影响均明显轻于 SFA，其机制可能是通过调节脂肪因子分泌，减轻肝脏 IR 与炎症浸润。

非酒精性脂肪性肝炎 单不饱和脂肪酸 脂肪因子 胰岛素抵抗

【 Abstract 】 Objective To investigate the effects ofmonounsaturated fatty acids(MUFA)on insulin resistance(IR)in rats with non-alcoholic steatohepatitis(NASH)and its molecular mechanisms.Methods Thirty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups,fed with normal diet(group C),high-fat diet with 10%olive oil(group M)or 10%lard (group S)diet for 12 weeks,respectively.The body weight was observed;surum transaminase blood lipids,fasting blood glucose and insulin were measured;live TG and FFA content was determined;and insulin resistance index (HOMA-IR)was calculated.The liver histopathological changes were observed with electron microscope,and the NAFLD activity score(NAS)was obtained.The expression ofIRS-1 was detected by Western blot.The levels ofTNF- α,IL-6,leptin(LP)and adiponectin(APN)in serum and liver were detected by sandwich enzyme-linked immunosorbant assay(ELISA). Results The NASH rat model was successfully established with high-fat diets for 12 weeks.Compared with those in group S,the body weight and liver TG content were decreased in group M.HOMA-IR index and NAS in group M were lower than those in group S(P＜0.05).The protein expression of hepatic IRS-1 in group M was increased by 60%,compared to those of group S(P＜0.05).The serum levels of TNF- α and LP increased in group S,Which were higher than those of group M(P ＜0.05).The serum and liver APN levels in groups M and S decreased significantly,compared with those in group C (P ＜0.05),the liver APN levels between groups M and S was no significant difference(P ＞0.05). Conclusion The long-term excessive intake of MUFA and SFA can induce peripheral and hepatic insulin resistance,resulting in NASH.Effects ofMUFA on plasma glucose and lipid levels,the fat content ofliver and IR are significantly lower than those of SFA.MUFA may improve hepatic IR and inflammatory infiltration by regulating the secretion of adipokines.

【 Key words 】 Non-alcoholic steatohepatitis Monounsaturated fatty acids Adipokines Insulin resistance

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是临床最常见的慢性肝病之一，被认为是代谢综合征的肝脏表现。非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是 NAFLD 进展的重要阶段，单纯性脂肪肝进展为 NASH 后可进一步经纤维化发展为肝硬化，甚至发生肝癌。NASH 发病机制包括胰岛素抵抗（IR）、慢性炎症反应、脂肪因子功能紊乱、脂质过氧化和氧化应激等[1]。研究已证实，长期摄入过量的脂肪酸可诱发营养性肥胖，其发病与 IR 密切相关，而不同类型脂肪酸对胰岛素敏感性的影响则不尽相同。其中，饱和脂肪酸（SFA）可通过直接激活 4 型 Toll样受体（TLR4）信号通路介导 IR[2]，而富含单不饱和脂肪酸（MUFA）的地中海饮食则可改善胰岛素敏感性，减少发生代谢综合征、2型糖尿病和心血管疾病的风险[3]。脂肪细胞分泌的脂肪因子如 TNF-α、IL-6、瘦素（LP）和脂联素（APN）等，可通过介导或参与不同的信号通路，影响肝脏胰岛素敏感性。本研究通过观察富含 MUFA 的高脂饮食对 NASH大鼠胰岛素敏感性的影响，比较血清和肝脏脂肪因子的变化，探讨饮食摄入 MUFA 影响 NASH 阶段肝脏胰岛素敏感性可能的分子机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物及试剂 30 只雄性 SD 大鼠，体重 140～160g，由中国科学院实验动物中心提供。实验试剂：猪油购自本地农贸市场，橄榄油购于上海化学试剂商店，ELISA 试剂盒为美国 R&D 公司产品，胰岛素受体底物-1 （IRS-1） 多克隆抗体为美国 Millipore 公司产品，RIPA 裂解液、蛋白定量试剂盒为上海碧云天生物公司产品，酶标仪为芬兰 Thermo 公司产品，凝胶成像分析系统为美国 Alpha 公司产品，光学显微镜为日本 Olympus公司产品。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型建立 （1）30 只 SD 大鼠用普通饲料正常喂养1周后按照随机数字表法分为正常饮食组（C组）、MUFA 饮食组（M 组）和 SFA 饮食组（S 组），每组10 只，称重后分别予普通饲料、富含 MUFA 和富含 SFA的高脂饲料喂养 12 周。两组高脂饮食（HFD）配方为88%普通饲料+10%脂肪酸+2%胆固醇，脂肪酸成分分别为富含 MUFA 的橄榄油[MUFA 82.3%，SFA 9.9%，多不饱和脂肪酸（PUFA）7.6%] 和富含 SFA 的猪油 （SFA42.7%，MUFA45.6%，PUFA8.5%）。已知每 100g 橄榄油和猪油的热量分别约为 899kcal和 897kcal，即两者所提供热量基本相同。造模开始后最初2周记录每日进食量，每 2 周称重并记录体重。12 周后到达造模终点，禁食12h 并称重，各组大鼠予 3%戊巴比妥钠溶液 30mg/ kg，麻醉后自下腹部经腹中线开腹，腹主动脉无菌注射器采血，收集于无致热源试管中，室温静置半小时后，于低温高速离心机 3 000r/min 离心 15min，取血清，分装后置于-80℃冰箱保存；迅速摘除肝脏组织，称肝脏湿重 ，计 算 IBM（体 重/身 长2）和 肝 指 数（肝 脏 湿重/体重×100%）。切取肝右叶相同部位肝脏组织约1cm×1cm×0.5cm，置于 10% 中性甲醛液中固定，石蜡包埋，制备 2μm 厚的切片，HE 染色后光镜下观察；取肝右叶适度大小组织块，分装于冻存管内，置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 生化指标检测 （1）应用全自动生化分析仪检测ALT、AST、TG、TC、空腹 血糖（FPG）和 胰 岛 素（INS）水平，计算稳态模式评估的胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）[FBG（mmol/L）×INS（ng/ml）/22.5]。（2）用 PBS 制 备 10%大鼠肝匀浆，酶法测定游离脂肪酸（FFA）含量，ELISA法测定 TG 含量。（3）ELISA 法检测血清和肝脏组织匀浆的 TNF-α、IL-6、LP 和 APN 水平。

1.2.3 肝脏组织病理检查及 NAS 评分标准 由病理科医师读片，根据 NAFLD 活动度积分（NAS）评价肝脏脂肪变性、炎症浸润及坏死程度，判断是否达到 NASH 诊断标准。NAS 积分为 0～8 分，标准如下：（1）肝脂肪变性：肝组织脂肪变性占所获肝组织标本量的范围＜5%计 0 分；5%～33%计 1 分；34%～66%计 2 分；＞66%计 3分；（2）小叶内炎症（200 倍镜下计数坏死灶）0 分：无；1分：＜2 个，2 分：2～4 个，3 分：＞4 个；（3）肝细胞气球样变：0 分：无；1 分：少量气球样变细胞；2 分：多见。NAS积分=1+2+3（NAS＜3 分可排除 NASH，NAS＞4 分则可诊断为 NASH，介于两者之间为 NASH 可能。

1.2.4 Western Blot半定量肝脏 IRS-1 蛋白表达 取肝组织标本匀浆后加入 RIPA 裂解液提取组织蛋白，BCA法蛋白定量；每泳道 50μg 蛋白标本上样，电转移至PVDF 膜后 进 行封闭 ，β -Actin 抗 体 （1∶500 稀 释）及IRS-1 抗体（1∶500 稀释）4℃过夜；洗涤后，辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000 稀释）室温孵育共 3h，ECL 检测、发光及显影。应用 Image J 软件进行图像处理，得到灰度比值进行统计学分析。

1.3 统计学处理 采用 SPSS 13.0 统计软件，计量资料以表示，3 组比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐时采用 LSD-t检验，方差不齐时采用Tamhane’s检验。

2 结果

2.1 造模终点各组大鼠体重和肝指数比较 见表 1、2。由表 1、2 可见，造模过程中大鼠未出现死亡，3 组大鼠体重呈进行性增长，每日进食量比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。自第 4 周起至 12 周造模终点，M 组和S 组大鼠体重均大于 C 组（均 P＜0.05），自第 8 周起，S组体重大于 M 组（均 P＜0.05）。12 周时，M 组和 S 组大鼠 IBM 和肝指数均高于 C 组（均 P＜0.05），S 组与 M 组间差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 造模过程中不同时点大鼠体重比较（g）

表2 造模终点 3 组大鼠体重、IBM 和肝指数比较

2.2 3 组大鼠血清生化指标和 HOMA-IR 比较 见表 3。

表3 各组大鼠血清生化指标和 HOMA-IR 比较

由表 3可见，与 C 组相比，M 组和 S组大鼠血清TG、TC、FPG 和 INS 水平均升高，HOMA-IR 增加（均P＜0.05）；其中，M 组 TG、FPG、INS 和 HOMA-IR 均低于 S组 （均 P＜0.05）；与 C 组相比，M 组和 S 组大鼠 ALT、AST 均升高（均 P＜0.05），M 组 AST、ALT 水平均低于 S组（均 P＜0.05）。

2.3 各组大鼠肝组织 TG 和 FFA 含量比较 见表 4。

表4 各组大鼠肝组织 TG 和 FFA 含量比较

由表 4 可见，与 C 组比较，M 组和 S 组大鼠肝组织TG、FFA 含量均增加 （均 P＜0.05），M 组 TG、FFA 含量均低于 S 组（均 P＜0.05）。

2.4 3 组大鼠肝脏组织病理检查所见 见图 2、表 5。

由图 2、表 5 可见，C 组大鼠肝组织无异常改变，12周时M组和S组大鼠肝组织均发生弥漫性脂肪变性，主要表现为以小泡为主的混合型脂肪变性，M组脂肪变轻于 S组；S组均发生小叶内炎症，以单核细胞为主的炎症细胞浸润明显，并出现融合成片的炎症坏死灶，M组炎症浸润程度较轻，组织坏死融合不明显；两组均出现明显的肝细胞气球样变；S组和 M 组大鼠均发生NASH，两组 NAS 积分差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 3 组大鼠血清和肝脏 TNF-α、IL-6、LP 及 APN 水平比较 见表6。

由表 6可见，与 C 组比较，S组大鼠肝脏和血清TNF-α 水平均升高，M 组仅肝脏 TNF-α 水平升高（均P＜0.05），且与 S 组间差异无统计学意义（P ＞0.05）。与C 组比较，M 组和 S 组大鼠血清 LP 水平均升高,且 M 组低于 S 组（均 P＜0.05），M 组与 S 组血清和肝脏 APN 水平均下降，其中，M 组血清 APN 水平高于 S 组（均 P＜0.05）。M 组血清 TNF-α 水平虽与 C 组差异无统计学意义（P ＞0.05），但低于 S 组（P＜0.05）。

2.6 3 组大鼠肝脏 IRS-1 蛋白表达情况 见图 3。

图2 3 组大鼠肝脏组织病理检查所见（HE 染色，×200）

表5 各组大鼠肝脏病理 NAS 积分情况[只（%）]

表6 3 组大鼠血清和肝脏 LP、APN、TNF-α 和 IL-6 水平比较

图3 各组大鼠肝脏 IRS-1 蛋白的表达 （与 C 组比较，*P＜0.05；与S 组比较，△P＜0.05）

由图 3 可见，与 C 组比较，12 周时，M 组和 S 组大鼠肝脏 IRS-1 蛋白表达均降低（均 P＜0.05）；其中，M组较 S 组相比上调约 60%，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

NASH 是 NAFLD 进展的关键阶段，肝脏发生炎症浸润及纤维化后，在多种因素的作用下可进一步向肝硬化甚至肝癌进展。笔者既往的研究已证实，予含 10%猪油的高脂饮食 12 周，可成功诱导与肥胖相关的 NASH大鼠模型[4]。长期高热量的高脂饮食可导致肥胖、IR、糖耐量受损、高脂血症、高 LP 血症及促炎性细胞因子增加等[5]。NAFLD 相关的肝脏 IR 与心血管疾病及 2 型糖尿病的等发病风险存在密切关系[6]。一方面，外周 IR 可促进肝脏内脂肪堆积，是 NAFLD 发病的重要诱发因素之一；另一方面，肝脏异位脂肪及其代谢产物可直接参与介导肝脏 IR，与 NAFLD 的病程进展密切相关。脂质介导 IR 主要通过两种机制：（1）肝脏甘油二酯（DCG）介导的蛋白激酶（PKC）激活作用，通过抑制具有激活 IRS作用的胰岛素受体激酶磷酸化，损害下游的胰岛素信号通路；（2）SFA 介导的 IR 则通过激活 TLR4 信号通路，诱导神经酰胺的自我合成增加，抑制 Akt磷酸化，产生胰岛素信号抑制作用[6]。

近年，针对不同类型脂肪酸对 NAFLD 影响的研究已成热点。SFA 已被证实可直接损害胰岛素敏感性，其可作为配体直接激活 TLR4 信号通路，促进 TNF-α、IL-6 等的释放，诱导慢性炎 症的发生，并加重 IR[2]。富含MUFA 的橄榄油可使 HFD 诱导的肥胖小鼠体重减轻，血清 TG、转氨酶下降，并使肝脏脂肪含量显著减少[7]。MUFA 可降低糖尿病人群的血清 LDL、TG 和 FBG 水平，并使 HDL 明显升高[8]。本研究结果显示，两组等热量的 HFD 均可引起大鼠体重进行性增长并发生肥胖，但M 组大鼠体重和肝指数的增长程度小于 S组，提示在等热量情况下 MUFA 可减少肥胖个体外周及肝脏脂肪堆积。最近，研究者对伴有 2型糖尿病或≥3种心血管疾病危险因素的肥胖人群，予富含橄榄油的地中海饮食5年后发现，该组体重较低脂饮食对照组下降，进而指出除热量和脂肪酸数量外，脂肪酸类型对肥胖个体的糖脂平衡产生重要影响[9]。本研究结果还显示，尽管两组HFD大鼠均达到 NASH 诊断标准，且出现糖耐量异常及肝细胞受损，但 M 组血脂、血糖和转氨酶水平均低于 S 组，肝脏的 TG、FFA 含量以及脂肪变和炎性浸润程度明显较轻。两组 NASH 大鼠均出现 IR，表现为 HOMA-IR 增加，肝脏 IRS-1 表达下降，但是 M 组的 IR 程度轻于 S组，表明在长期饮食摄入等热量 SFA 和 MUFA 诱发NASH 时，MUFA 对肥胖个体胰岛素敏感性的损害轻于SFA，其可能是通过调节 IRS 介导的 DCG-PKC 通路实现的。近期研究发现，TLR4 基因敲除小鼠予 SFA 和MUFA 饮食后均可导致肝脏 IR，故认为两者可能通过激活 DCG-PKC 以抑制 IRS 介导的胰岛素信号转导，而非通过 TLR4 信号通路影响胰岛素敏感性[10]。

作为储能场所和内分泌器官，脂肪细胞不仅参与机体能量代谢，还可分泌多种脂肪细胞因子，包括 LP、APN、TNF-α 及 IL-6 等[11]。TNF-α 可作用于肝细胞上的相应受体，通过诱导 IRS-1/IRS-2 丝氨酸磷酸化、抑制其酪氨酸磷酸化，损害胰岛素信号通路，加重 IR；亦可通过下调 APN、IRS-1 等的表达损害胰岛素敏感性。IL-6 可通过抑制 IRS-1、GLUT4 等的表达来引发肝脏 IR。LP 可刺激脂肪组织内的巨噬细胞产生 TNF-α、IL-6等，进而促进单纯性脂肪肝向 NASH 转变。APN 可抑制TNF-α 的合成，减少肝脏脂肪堆积和炎症反应[12]。本研究结果显示，在 NASH 阶段，两组 HFD 大鼠肝脏 IRS-1表达出现不同程度下降的同时，血清及肝脏脂肪细胞因子的表达出现相应的变化：两组大鼠均出现不同程度的血清 LP 和 TNF-α 增加，血清及肝脏 APN 减少，而 IL-6则无显著增加；提示体循环中的瘦素抵抗及低脂联素血症可能对 NASH 阶段的胰岛素敏感性产生影响，而 IL-6 呈现出低水平表达，表明在该研究的 NASH 阶段，脂肪因子及炎性细胞因子表达可能出现失衡状态。MUFA可能通过对外周脂肪细胞体积的影响以及分泌功能的作用，调节脂肪细胞因子的分泌；其分子机制可能是通过显著抑制巨噬细胞及脂肪组织炎症因子基因的 mRNA 表达，进而降低促炎细胞因子的分泌，提高胰岛素敏感性[13]。需指出的是，本文仅针对长期饮食摄入 HFD进行研究，因为该造模过程更接近人类 NASH 发病的诱发模式。此过程中除脂肪细胞因子水平发生变化外，还应考虑饮食摄入脂肪酸对肠粘膜通透性和肠道菌群等产生的影响[14]，并需要明确 HFD 相关肠源性内毒素 血症对 IR 的作用，这也提示该研究存在一定的局限性与不足。Pereira 等[13]通过对大鼠短期静脉注射 MUFA、SFA发现，两类脂肪酸均可诱发同等水平的肝脏及外周 IR，且肝脏 IR 先于外周 IR、炎症和脂质堆积等发生，DAGPKC 通路激活在其中发挥关键作用。由此可见，饮食来源脂肪酸对 IR 的影响是一个复杂的多因素参与的过程，除脂肪酸类型外，干预时间长短及干预途径亦与 IR程度密切相关。本研究间接证实，脂肪酸通过激活DAG-PKC、抑制 IRS 表达干预肝脏胰岛素信号转导，影响胰岛素敏感性，这为未来 NAFLD 的治疗策略中，针对肝脏 IR 进行相关分子干预提供了方向。

综上所述，长期、过量地摄入 SFA 和 MUFA 均可诱发 NASH 发生，其中，MUFA 对糖脂代谢、肝脏脂肪含量及外周脂肪堆积等的影响程度显著轻于 SFA。MUFA 可能通过参与调节脂肪因子分泌，减轻肝脏 IR 与炎症浸润。因此，通过对肥胖相关的 NAFLD 患者进行生活方式干预，改变饮食摄入脂肪酸的类型，以适量的富含MUFA 饮食替代 SFA，可延缓 IR 相关 NAFLD 的病程进展，并可进一步减少 2型糖尿病和心血管疾病等的发病风险。

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Effect of monounsaturated fatty acids-rich diet on insulin sensitivity in rats with non-alcoholic steatohepatitis

LI Nan,XU Zhengjie,DUAN Xiaoyan,et al.
Department of Gastroenterology，Zhejiang Hospital，Hangzhou 310013,China

2016-12-16）

（本文编辑：马雯娜）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.11.2016-2113

王宝恩抗肝纤维化基金项目（20110006）

310013 杭州，浙江医院消化内科（李楠、郑培奋）；上海交通大学医学院附属新华医院消化科（徐正婕、段晓燕）

徐正婕，E-mail：ajanexu@126.com