脾胃湿热与变应性鼻炎模型小鼠相关性的初步研究*

屈静廉海红刘畅王向东

·实验研究·

脾胃湿热与变应性鼻炎模型小鼠相关性的初步研究*

屈静1廉海红1刘畅1王向东2

目的探讨脾胃湿热与变应性鼻炎（allergic rhinitis,AR）发病的内在关系。方法8～10周龄雄性BALB/c小鼠30只，随机分为空白组、AR模型组和“脾胃湿热+AR”组，比较观察三组鼠的行为学、病理改变，以及关键细胞因子IL-4、IFN-γ水平的组间差异。结果各组小鼠的行为评分、病理改变及细胞因子IL-4、IFN-γ的组间差异均存在显著性统计学意义（P＜0.01）。结论脾胃湿热状态与变应性鼻炎发病存在密切关系。

变应性鼻炎；脾胃湿热；相关性；病机特征

变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)，即过敏性鼻炎，是机体接触变应原后主要由IgE介导的鼻黏膜非感染性炎性疾病[1]。流行病学研究显示，变应性鼻炎发病率在世界范围的发病率为10%～25%[2]，在我国中心城市8.7%～24.1%[3]。目前，变应性鼻炎动物模型的制备方法比较成熟。脾胃湿热动物模型的制备近10年来得到不断发展、改进，研究者已经成功制备[4-6]。据前期的临床观察，脾胃湿热在变应性鼻炎发病中起着重要作用，本研究拟建立脾胃湿热的动物模型，观察其症状学、病理学、细胞因子的改变，以期从实验角度证实。

材料与方法

1材料

1.1 实验动物

采用SPF级、8～10周龄雄性BALB/C小鼠，体重最低17.7g，最高21.6g，平均体重19.81±0.96g，共30只，购于维通利华公司。在北京市眼科研究所屏障系统动物房饲养，恒温恒湿的环境下，固体饲料，适应性饲养7天后开始正式实验。30只小鼠随机分为三组：脾胃湿热并变应性鼻炎模型组、变应性鼻炎模型组、空白组。

1.2 试剂及药品

卵清蛋白（Ovalbumin，OVA，sigma公司）、氢氧化铝[Al(OH)3，上海美兴化工股份有限公司]、生理盐水、蜂蜜水、猪脂、55度白酒、10%甲醛、10%依地酸钠钙（EDTA）、石蜡、鼠IL-4、IFN-γELISA检测试剂盒（BD公司）。

2方法

2.1 AR模型

按Ogasawara H等[7]和Yuhui Ouyang等[8]方法稍加改动，基础致敏阶段（1～14天）：OVA 50μg/只加入免疫佐剂Al(OH)3（5mg/只）制成生理盐水混悬液1ml，予小鼠腹腔注射，隔天1次，共7次；激发阶段（15～21天）：以5%OVA 20μL/只点鼻，1次/d，共7次。

2.2 脾胃湿热+AR模型

与AR造模基础致敏阶段同时进行。

采用吕冠华等[9]、刘冬梅[10]方法稍加改善，第1-5天，将小鼠单日禁食(自由饮水)，双日正常饮食，自第6天起每日每只小鼠给予20%（200g/L）蜂蜜水，自由饮用，不再给其他饮水。第7、9、11、13天，每只小鼠灌服白酒10ml/kg，第6、8、10、12、14天每只给予猪脂30g/kg。第15～21天，恢复正常饮食、饮水，与AR模型组处理完全相同。

2.3 与造模同时进行的对照处理

在脾胃湿热状态造模的同时，空白组和AR模型组置于正常环境下正常饲料喂养，自由饮水。AR造模时，空白组给予同等剂量生理盐水作致敏液，激发期给予等剂量生理盐水滴鼻。

3观察项目

3.1 观察一般情况

观察并详细记录每日小鼠的皮毛、状态、体重、大便、行为、状态。

3.2 鼻部症状观察

末次即第21天鼻腔滴药后30分钟，观察小鼠搔鼻、喷嚏、流清涕鼻部症状，并进行评分。

评分标准按照赵秀杰等[11]采用，陈炜等[12]稍加改进的积分办法。鼻痒:无抓鼻为0分，抓鼻1～5次为1分，5次以上为2分；喷嚏:无喷嚏0分，1～3个为1分，4～10个为2分，11个以上为3分；清涕:无鼻涕为0分，流至前鼻孔为1分，超出前鼻孔为2分，涕流满面为3分。

3.3 血清IL-4、IFN-γ测定

将小鼠用摘眼球法取眶内动静脉血液，装于抗凝管内，放入离心机内离心，3000转/分钟，5分钟，再用微量移液器取上清液，置于-80℃冰箱保存，采用IL-4、IFN-γ鼠试剂盒以双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)进行检测。

3.4 鼻黏膜病理改变

取血后将小鼠断头处死，分离组织，剪去鼻腔周围骨性结构，将整个鼻腔取出，用10%甲醛固定，用10%EDTA脱钙，以针刺鼻甲骨性结构无阻力为标准，进行石蜡包埋，行苏木素—伊红(HE)染色，莱卡组织切片机将标本做4μm厚切片。应用奥林帕斯光镜，视野（×10-×400）倍观察。

4统计分析

采用SPSS 13.0统计软件包，全部数据按计数资料、计量资料选择统计方法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

实验结果

1病理观察

每个标本任选3张切片，应用奥林帕斯光镜，自低倍视野（×10）至高倍视野（×400）观察。主要观察项目有黏膜是否完整，有无渗出、出血，嗜酸粒细胞数目。

脾胃湿热+AR模型组中可见鼻中隔黏膜有明显渗出、出血，黏膜内及髓腔见大量嗜酸粒细胞浸润，AR模型组中可见鼻中隔粘膜较上组出血、渗出情况要好，黏膜不连续，内见嗜酸粒细胞浸润，空白组偶见嗜酸粒细胞、鼻黏膜完整、连续。典型片如下。

2末次激发后小鼠症状评分比较

比较各组小鼠体重。末次鼻腔滴药后30分钟，观察小鼠搔鼻、喷嚏、流清涕3个鼻部症状，并进行评分，见表1。

表1 三组小鼠实验前体重、实验后症状评分比较（分，±s）

表1 三组小鼠实验前体重、实验后症状评分比较（分，±s）

体重症状评分脾胃湿热+AR模型组AR模型组空白组P 19.88±0.99 19.63±1.06 19.81±0.96 P＞0.05 4.5±0.71 2.67±1.03 0.5±0.58 P＜0.05

比较实验前各组小鼠体重，无明显差异。各组分数比较，P＜0.01，应用LSD法两两比较：“空白组”与“AR模型组”P＜0.01，“AR模型组”与“脾胃湿热+ AR模型组”P＜0.05。

统计分析表明，三组造模后变应性鼻炎评分有显著差异，两两比较也有显著差异。

3三组小鼠体征比较

空白组小鼠在整个饲养、造模过程中，毛色鲜亮，活动灵敏；“脾胃湿热+AR模型组”在造模开始后5天始，逐渐毛色稀疏、无光泽，精神差，活动迟缓；“AR模型组”自进入造模激发阶段，逐渐有毛发脱落、光泽变差。如下图示。

4血清IL-4、IFN-γ的测定

用摘眼球法取眼眶内动静脉血液，由中心实验室技术人员进行离心，3000r/min，5分钟，取血清，置于-80℃冰箱保存。应用IL-4、IFN-r鼠试剂盒以双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)进行测定。结果如下，见表2。

表2 三组细胞因子测试结果比较（pg/m l，±s）

表2 三组细胞因子测试结果比较（pg/m l，±s）

IL-4（pg/ml）IFN-r（pg/m l）脾胃湿热+AR模型组AR模型组空白组P 19.52±10.34 13.21±9.87 8.54±9.11 P＜0.01 11.87±10.51 7.86±6.70 5.67±6.45 P＜0.01

应用spss13.0统计软件，采用方差分析方法。三组IL-4和IFN-r含量有显著差异，并且“脾胃湿热+ AR模型组”与“AR模型组”之间有显著差异，“AR模型组”与“空白组”之间有显著差异。

讨论

变应性鼻炎的免疫反应过程是体外环境作用于机体导致异常免疫反应，造成Th1(1型辅助性T细胞)和Th2（2型辅助性T细胞）免疫反应失衡引发的以鼻腔黏膜Th2免疫反应为主的变应性炎症反应[13-15]。细胞因子对变应性炎症的调节作用被逐步阐明[15]。

Th1细胞主要分泌白细胞介素2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ），介导细胞免疫反应，Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5，促进体液免疫反应。在变应原致敏阶段，Th2细胞分泌IL-4刺激B细胞合成IgE。在速发相反应阶段，肥大细胞产生炎性介质，引发急性变应性反应。同时，肥大细胞还产生IL-4和IL-5。另外，T细胞、巨噬细胞等还可分泌神经营养素，参与慢性变应性反应[16]。本研究测定IFN-γ、IL-4正是变应性鼻炎病理机制中的关键作用因子，更好的反应脾胃湿热状态对变应性鼻炎免疫反应进程的影响。结果显示，在三组小鼠实验完成后，IFN-γ、IL-4三组之间有显著差异，两两对照，亦有差异，说明变应性鼻炎疾病小鼠较正常小鼠的免疫因子高，脾胃湿热状态下，免疫因子较单纯变应性鼻炎状态的免疫因子高。脾胃湿热状态在变应性鼻炎发病中有着促进作用。之前有学者研究证实脾胃湿热证大鼠免疫功能低下，应用治疗脾胃湿热的中药有恢复机体免疫功能的作用[17]。亦说明出中医脾胃湿热状态时鼠的免疫功能下降，从而对变应性鼻炎发生发展起到推进作用。

通过病理学检测和体征观测的结果，亦反应出，在脾胃湿热的条件下，小鼠的变应性鼻炎体征表现更显著，变应性鼻炎评分之间有显著差异，鼻黏膜的病理性变化更加明显。

脾胃湿热是目前临床上变应性鼻炎的常见证候，在现代社会中，环境因素，生活压力增大，饮食不规律、嗜食肥甘厚味，熬夜等生活方式的变化，导致人群中脾胃湿热证候状态逐渐增加。内在证候状态加之外在过敏原，从而发生变应性鼻炎。关于脾胃湿热的实验研究随之增多，形成了比较成熟的造模方法，本次脾胃湿热模型综合了饥饱失常、进食油腻、饮酒等因素而成。

此次从基础实验角度证实了脾胃湿热与变应性鼻炎发病的内在关系，认为中医脾胃湿热状态与变应性鼻炎发病存在密切关系。当然，本研究在样本量上还可以扩充，在设计方案也能再增加诸如中药治疗组，这有待于下一步深入研究。

1中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编委会,中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会鼻科学组.变应性鼻炎诊断和治疗指南[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2009,44(12): 977-978.

2 Strachan D,Sibbald B,Weiland S,et al.Worldwide variations in prevalence of symptoms of allergic rhinoconjunctivitis in children[J].Pediatr Allergy Immunol,1997,8: 161.

3 Luo Zhang,Demin Han,Dan Huang,et al.Prevalence of Self-Reported Allergic Rhinitis in Eleven Major Cities in China[J].Int Arch Allergy Immunol,2009,149:47-57.

4吕冠华,劳绍贤.脾胃湿热证动物模型的建立与评价[J].广州中医药大学学报,2005,22(3):231-235.

5朱星,廖荣鑫,吕东勇.脾胃湿热证大鼠HPA轴改变机制的研究[J].新中医，2010,42(10)：115-116.

6韦嵩,劳绍贤.脾胃湿热证大鼠模型复制及其水通道蛋白表达的研究[J].广州中医药大学2005届博士毕业论文.

7 Ogasawara H,Asakura K,Saito H,Kataura A Role of CD4-positive T cells in the pathogenesis of nasal allergy in themurinemodel[J].Int Arch Allergy Immunol,1999, 118:37-43.

8 Yuhui Ouyang,Masanori Miyata,Kyosuke Hatsushika, and Atsuhito Nakao,Hideoki Ogawa.TGF-Signaling May Play a Role in the Development of Goblet Cell Hyperplasiaina Mouse Model of Allergic Rhinitis[J].Allergology International,2010,59:1-7.

9吕冠华,劳绍贤.脾胃湿热证的动物模型的建立与评价[J].广州中医药大学学报,2005,22(3):231.

10刘冬梅.健脾安中方对脾胃湿热大鼠胃粘膜环核苷酸含量的影响及组织病理学观察[J].中国中西医结合消化杂志,2000,9(3):60.

11赵秀杰,董震,杨占泉,等.鼻超敏反应实验模型的建立[J].中华耳鼻咽喉科杂志,1993,28(1):17-18.

12陈炜,陈晴,付雨,等.肺气虚与变应性鼻炎的免疫相关性研究[J].成都中医药大学学报,2007,30(2):42-44.

13 Kay AB.Allergy and allergic diseases:first of two parts[J]. N Engl JMed,2001,344:30-37.

14 Bames PF.Th2 cytokines and asthma:an introduction[J]. Respir Res.2001,2:64-65.

15 Togias A.Rhinitis and asthma:evidence for respiratory system intergration[J].JAllergy Clin Immunol,2003,111 (6):1171-1183.

16张罗,周兵,韩德民,等.变应性鼻炎研究进展[J].耳鼻咽喉头颈外科,2003(5):316-320.

17武凯歌,文小敏,洪冰.王氏连朴饮对脾胃湿热证大鼠血清IL-2、IL-6等的影响[J].江苏中医药,2010,42(5): 71-72.

（收稿:2016-09-21修回：2016-11-04）

A prelim inary evaluation on the association of sp leen-stomach dam p-heatw ith experimental allergic rhinitis amongm ice

QU Jing,LIAN Haihong,LIU Chang,WANG Xiangdong
Department of Traditional Chinese Medicine,Affiliated Beijing Tongren Hospital,Capital Medical University, Beijing,100730,China

Objective To preliminarily evaluate the association of spleen-stomach damp-heatwith allergic rhinitis(AR)based on an experimental study amongmice.M ethods Thirtymice were random ly divided into 3 groups,i.e.blank group(BG),AR model group(AMG)and spleen-stomach damp-heat plus AR group(PSDHAG).Determined were the changes of experimental animals in their behavior,histopathology and the related key factors IL-4 and IFN-γamong different groups in a comparative way.Results There were significant differences in the changes of behavior,histopathology and the related key factors IL-4 and IFN-γamong different groups as shown from the results with obviously statistical significance(P＜0.01).Conclusion There should be a close association of spleen-stomach damp-heatwith the developmentof allergic rhinitis in its pathogenesis in the terms of TCM.

Allergic rhinitis;Spleen-stomach damp-heat;Association;Pathogenesis features

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2017.02.001

①脾胃湿热与变应性鼻炎模型鼠血清Th1/Th2细胞因子相关性研究（首都中医药专项课题13ZY13）

②清肺健脾法治疗持续性变应性鼻炎的即刻、远期疗效评价（首都卫生发展科研专项项目2014-2-2051）

1首都医科大学附属北京同仁医院传统医学科（北京，100730）；北京市中西医结合耳鼻咽喉科研究所

2北京市耳鼻咽喉科研究所；首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉科头颈外科

屈静，副主任医师.Email:crgjaa@126.com.