大叶石上莲ISSR—PCR反应体系的建立与优化

傅琼+王英强

摘 要 为建立并优化大叶石上莲（Oreocharis benthamii）ISSR-PCR反应体系，采用改良的CTAB法提取大叶石上莲叶片DNA，利用正交試验设计方法，从Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶以及模板DNA 5因素4水平，对大叶石上莲 ISSR-PCR 反应体系进行优化，确立了适用于大叶石上莲的扩增多态性高、稳定性强、条带清晰的ISSR最佳反应体系：2.0 μL的10×PCR 缓冲液，2.0 mmol/L Mg2+，0.25 mmol/L dNTP，0.7 μmol/L 引物，2.0 U Taq DNA聚合酶，30 ng DNA模板（20 μL反应体系）。在此基础上，从100条引物中筛选出13条ISSR扩增引物，其中5条引物最为合适并已确定其最佳退火温度。

关键词 大叶石上莲 ；ISSR ；正交设计 ；反应体系 ；引物筛选

中图分类号 S339.1 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.05.006

Optimization and Establishment of ISSR-PCR Reaction System for

Oreocharis benthamii

FU Qiong WANG Yingqiang

（Guangdong Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development， College of Life Sciences，

South China Normal University， Guangzhou， Guangdong 510631）

Abstract An attempt was made to establish and optimize a stable ISSR-PCR reaction system for Oreocharis benthamii. The leaf DNA of O. benthamii was extracted by using the modified CTAB protocol. An orthogonal design was arranged to optimize ISSR-PCR amplification system with five factors （Mg2+， dNTP， primer， Taq DNA polymerase and DNA template） at four levels， based on which a satisfactory ISSR-PCR reaction system for O. benthamii with high polymorphism， desirable repeatability and clear band patterns was established. This system was a total volume of 20 μL ISSR-PCR system that contained 2.0 μL 10×PCR buffer， 2.0 mmol/L Mg2+， 0.25 mmol/L dNTP， 0.7 μmol/L primer， 2.0 U Taq DNA polymerase， and 30 ng DNA template. With this reaction system 13 ISSR primers were screened from 100 primers， of which five primers were found optimum and their annealing temperatures were proposed.

Keywords Oreocharis benthamii ； ISSR ； orthogonal design ； reaction system ； primers screening

大叶石上莲（Oreocharis benthamii）是苦苣苔科马铃苣苔属（Oreocharis）的一种多年生草本植物，为我国华南地区特有物种，一般生长在石灰岩密林下阴湿处，生境相对特殊，其分布范围以广东、广西的华南地区最为集中[1-2]。苦苣苔科植物为我国南方卡斯特生境的代表性植物类群，其生境十分脆弱[3]。长期以来，大面积的天然林被砍伐，资源被过度开发利用，环境问题日益突出等使植物赖以生存的环境遭到严重破坏，而对生境要求极为苛刻的大叶石上莲来说，生境一旦被破坏即难以恢复。目前苦苣苔科的大多数种类处于濒危状态，而生境明显退化是该科植物濒危的主要原因[4-5]。以往关于大叶石上莲的研究主要集中在CYC花对称基因表达[6]、繁育系统[7]、系统学[8-9]等方面。然而随着分子生物学技术的发展，利用以PCR为基础的分子标记，加快并深入对大叶石上莲的遗传多样性、遗传结构等研究和保护工作是当务之急。

ISSR（简单序列重复区间多态性，Inter Simple Sequence Repeat）分子标记是Zietkeiwitcz[10]等在1994年对微卫星技术发展起来的一种分子标记，可用来检测两段SSR之间一段短DNA序列的多态性。相对于AFLP[11]、RAPD[12]、SSR[10]等分子标记，该技术虽然为显性标记，不能区分纯合体和杂合体，但是其多态性高、操作简便、成本低。目前该技术已被广泛应用于遗传多样性检测[13-14]、种质资源鉴定[15-16]、遗传图谱构建[17]等方面研究。本文根据正交试验设计方法，从5因素（Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶以及模板DNA）4水平对大叶石上莲ISSR-PCR反应体系进行优化，以期获得大叶石上莲的最佳ISSR扩增反应，为下一步大叶石上莲种质资源的遗传多样性研究提供可靠的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所需材料采自广东、广西等地的大叶石上莲。每个样品选取植株中幼嫩叶片（1～2片），清洗并迅速放入茶葉袋，加硅胶快速干燥，封口保存并放入-70℃超低温冰箱备用。采集标本放置华南师范大学生命科学学院标本馆。

用于ISSR-PCR反应的PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2+均购自 TaKaRa公司。标准分子量（Marker）DL15 000和DL100购于广东东盛生物科技有限公司。所用引物采用加拿大哥伦比亚大学设计公布的引物序列，由上海生工生物工程公司合成。经初步筛选，引物UBC841[（GA）8Y*C；*Y代表G/C]作为此次正交试验的引物。GoldViewTM核酸染料购自北京赛百盛基因技术有限公司。PCR反应在美国BIO-RAD公司温度梯度PCR循环仪上进行。叶片研磨过程在冷冻混合球磨仪MM400（德国Retsch公司）中进行。

1.2 方法

1.2.1 总DNA的提取

根据邹喻苹[18]的CTAB法，并加以改进，提取大叶石上莲基因组DNA，利用紫外可见分光光度计（ALLSHENG： Nano-100）检测 DNA的纯度和浓度。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并将其浓度稀释至25 ng/μL，置于-20℃储存备用。

改良CTAB法：（1）研磨后加预处理液（2% β-巯基乙醇；6% PVP；洗液（0.2 mol/L Tris-HCl pH 8.0，50 mmol/L EDTA，pH=8.0，0.25 mol/L NaCl）震荡混匀，放置-20℃ 10 min，12 000 r/min，4℃。（2）取出研磨珠；（3）CTAB提取液（2%的CTAB，pH 8.0的100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2% β-巯基乙醇）。

1.2.2 PCR扩增

基于已有的研究[19]，本文确定的扩增程序为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，46～60℃退火45 s，72℃延伸90 s，共40个循环，后72℃延伸10 min，4℃低温保存。1.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

1.2.3 正交试验设计

根据邵果园[19]大岩桐反应体系，本文设计L16（45）正交试验因素及水平，其中5个因素和4个试验水平见表1，具体试验组合见表2。ISSR试验总体积采用20 μL反应体系，每个反应管内加有1 × PCR Buffer，并用无菌水补至20 μL。将19个处理[另3管为阴性对照（不加模板）]各试验2次。引物UBC 841的退火温度根据其Tm值最初确定为56.3℃。参照何正文[20]等的方法，依据扩增条带的敏感性、特异性及稳定性即条带的强弱及杂带的多少做1～16分计分，分数越高则表明敏感性、特异性和稳定性越好，2次重复分别统计。

1.2.4 引物筛选及最佳退火温度的确定

从5个地理距离相距较远的居群中分别选取2个DNA模板，利用优化的反应体系从100条ISSR引物中进行扩增筛选。再根据PCR仪器自动形成的12个退火温度梯度（46、46.4、47.2、48.3、49.9、52、54.3、56.3、57.8、58.9、59.7、60℃），从而最终确定每条引物的最佳退火温度。

1.2.5 体系稳定性检测

根据1.2.4筛选得到的条带清晰、稳定性强、多态性高的引物，随机选择其中的引物和不同居群的样品进行ISSR-PCR扩增，检测优化体系在不同居群的稳定性。

2 结果与分析

2.1 DNA浓度与纯度检测

采用改进的CTAB法提取的大叶石上莲DNA OD值A260 nm/A230 nm介于1.80～2.05，表明所提取的DNA纯度较好（表3）。并且从琼脂糖凝胶电泳结果也能够看出，改良CTAB法所提取的DNA条带更加明亮，并具有单一的、较完整的高分子量条带，且加样孔没有残留的杂质（图1）。无论是在DNA纯度还是浓度上，改进的CTAB法比传统的CTAB法效果更佳，可用于后续ISSR-PCR反应。

2.2 PCR反应体系的优化结果

大叶石上莲ISSR-PCR正交试验的电泳结果（图2）表明，处理3、4、5、11、12、13、14、15扩增条带较多。其中以处理4、11、12的条带更为清晰，主带更加明显。因此，这3个处理在大叶石上莲ISSR-PCR扩增反应中效果较好。

参照何正文[20]的方法，对扩增结果依次计分：7、7；7、4；14、14；16、16；12、10；6、11；5、5；7、7；2、5；2、2；14、14；14、14；10、10；12、12；11、11；2、5。根据分数求出每个因素在同一水平下的试验值之和的平均值（ki），并求出同一因素不同水平间平均值的极差（R）（表4）。极差R越大，代表影响因素对反应体系的影响情况越显著。由表4可知，Taq酶浓度对大叶石上莲ISSR-PCR反应的影响最大，其次为Mg2+和dNTP，DNA 模板和引物的作用较小。5个因素的最佳水平并未在处理组合中出现，但分值最高的4号处理与其较接近，并且4号处理的3个较大影响因素的浓度，与最佳水平相近，考虑到节约DNA模板，最终确定大叶石上莲的最佳反应体系为4号处理，即在20 μL反应体系中包括2.0 μL的10×PCR缓冲液，2.0 mmol/L Mg2+，0.25 mmol/L dNTP，0.7 μmol/L引物，2.0 U Taq DNA聚合酶，DNA模板30 ng。

2.3 引物筛选及退火温度的确定

根据最佳反应体系，从100条ISSR引物中共筛选出13条引物。其中5条引物具有更强的重复性、稳定性和条带清晰性，并对其进行梯度温度退火实验，确定最佳退火温度（表5）。对引物UBC 879的退火温度进行梯度筛选，结果（图3）表明，退火温度低于49.9℃时，亮度低，且主带有弥散；随着49.9℃退火温度的升高，引物与模板结合差，扩增条带少且模糊，主条带不明显。当退火温度为49.9℃时，条带清晰，主条带明显、亮度高且稳定性强。所以，引物UBC 879的最佳退火温度为50℃。

2.4 最优体系的检验

利用最佳的反应体系对大叶石上莲2个居群（共42个个体）进行ISSR-PCR扩增，结果显示该扩增反应体系稳定性强、条带清楚、多态性高，因而此反应体系可适用于大叶石上莲的遗传多样性分析（图4、5）。

3 结论与讨论

DNA提取是进行分子生物学研究的重要步骤，而高质量、高浓度的DNA不仅有利于下游实验进行，而且可以减少DNA的浪费[21-22]。有研究表明，当A260/A280小于1.8时，DNA中可能有蛋白质污染，当A260/A280大于2.0时，DNA中可能有RNA污染[23]，而当A260/A230低于2.0时，DNA中可能有碳水化合物、盐、酚类等污染[24]。从大叶石上莲提取的DNA纯度（A260/A280、A260/A230）和浓度来看（表3，图1），传统CTAB法提取效果均低于改良CTAB法。这可能是大叶石上莲叶片本身含有较高的多糖、多酚等物质，而利用传统CTAB法提取大叶石上莲DNA，其多糖、多酚不能去除干净，这些残留的物质与DNA 共沉淀，形成粘稠的胶状物，难以溶解以及产生褐变[21]。但利用改進的CTAB法提取大叶石上莲DNA，在细胞膜破碎前的研磨过程中加入少量的PVP，并在预处理液和CTAB中加入适量的β-巯基乙醇，这种做法可有效地抑制多酚的氧化反应，防止褐化，同时能够有效的去除多糖，并且还具有较高的DNA浓度。在加入CTAB之前将研磨钢珠取出，可有效避免因机械碰撞而导致DNA断裂的后果。

ISSR-PCR扩增反应容易受多重因素的影响，例如：Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、引物退火温度等[25-26]。许多研究表明，影响ISSR-PCR反应的最大因素是Taq DNA聚合酶[27]和Mg2+[28]，本研究结果与其具有一致性。在PCR反应过程中，如果Taq酶用量过高，将会导致扩增条带弥散，积累大量的非特异性条带，并且也提高了实验成本[27]。适合的Mg2+浓度也非常重要，低的Mg2+浓度会降低Taq酶的活性，从而使反应产物减少。并且Mg2+还能与反应中其他因素结合，影响PCR的效应及特异性[28]。然而在本研究中，dNTP也表现出较大的影响性，由于dNTP是PCR的原料，其浓度太高产生错误掺入，浓度太低产率太低[18]。本研究中模板DNA的用量对PCR扩增的影响较小，可能是因为本研究所选择的浓度范围恰好在可影响区间内，但是其纯度对扩增效果具有较大的作用。当模板DNA纯度较高时，DNA用量少且能扩增出较好的结果，而纯度较低时，DNA样品中的多糖、多酚及蛋白质等都会干扰扩增反应。除了以上因素，引物的退火温度对扩增反应的影响也相当重要，不同的引物在同一物种内具有不同的最佳退火温度，而同一引物在不同的物种中也具有不同的最佳退火温度。

综上所述，一个适宜的ISSR-PCR扩增反应体系受到多重方面的影响。本研究结果表明，通过正交设计试验方法优化得出的大叶石上莲ISSR-PCR扩增反应体系具有较高的稳定性，可用于今后大叶石上莲种质资源遗传多样性研究。

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