应用iTRAQ技术筛选先天性心脏畸形胎儿母亲血清差异表达蛋白

陈骊珠，马巍，张墨，袁正伟

（中国医科大学附属盛京医院1.超声科；2.国家卫生和计划生育委员会小儿先天畸形重点实验室；3.泌尿外科，沈阳110004）

应用iTRAQ技术筛选先天性心脏畸形胎儿母亲血清差异表达蛋白

陈骊珠1，马巍2，张墨3，袁正伟2

（中国医科大学附属盛京医院1.超声科；2.国家卫生和计划生育委员会小儿先天畸形重点实验室；3.泌尿外科，沈阳110004）

目的筛选先天性心脏畸形（CHD）母体血清差异表达蛋白质，明确和CHD相关的候选标志物。方法收集40例CHD胎儿（实验组）母亲血清和10例正常胎儿（对照组）母亲血清，其中实验组包括法洛氏四联征10例，室间隔缺损10例，共同动脉干10例，其他少见先天性心脏畸形10例。每组10例标本等体积混合后，应用同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ）对蛋白质进行鉴定和相对定量。结果孕妇外周血血清中共鉴定到蛋白质606个，实验组与对照组差异达到1.5倍以上的蛋白质47个，其中23个在实验组中上调，24个在实验组中下调。结论基于iTRAQ技术的蛋白质组学方法能鉴定出多种CHD相关的差异蛋白，CHD发生是一个多种蛋白质分子参与的结果。

同位素标记相对和绝对定量技术；先天性心脏畸形；蛋白质组学；血清标志物；产前诊断

先天性心脏畸形（congenital heart defect，CHD）是最常见的先天畸形之一，30%～50%的新生儿死亡都是由CHD造成的［1］。我国每年有10万～15万CHD患儿出生，CHD是新生儿时期的主要死亡原因之一，对患儿及其亲属乃至整个社会都造成沉重的负担。因此，CHD的早期诊断以及发生机制的研究对于开展CHD的预防或产前干预具有十分重要的意义。目前CHD的产前诊断主要依赖于产前超声检查［2］，然而胎儿超声心动图仅在一些产前诊断中心得以开展，只有少部分高危妊娠孕妇能够得到检查，并且诊断准确率受操作者主观诊断能力影响较大。因此，急需研究一种能够早期诊断CHD的分子标志物。

以蛋白质组学为基础，在孕妇的血清、羊水以及代谢产物中筛选出妊娠相关分子标志物方面的研究取得了显著进展［3］，妊娠早期在孕妇外周血中应用特异标志物进行特定疾病的诊断成为可能。目前，蛋白质组学技术在产前主要应用于染色体异常胎儿标志物的筛查［4-6］，对胎儿结构畸形产前标志物筛查的研究甚少。随着蛋白质组学技术的不断发展，各种各样蛋白质组学技术应运而生。其中，同位素标记相对和绝对定量技术（isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ）是一种新型的蛋白质组学定量研究技术，可以同时对8种不同来源的样本进行绝对和相对定量，鉴于其具有高通量、定量效果好、重复性高，标记效率高达97%等优势，目前广泛应用于肿瘤标志物及产前诊断标志物的筛查研究［7-9］。KOLLA等［10］应用iTRAQ技术分析了唐氏综合征胎儿与正常胎儿孕妇血清蛋白表达差异，发现了包括β-HCG（目前临床上唐氏综合征产前筛查的标志物之一）在内的多个蛋白表达上调，这也证实了iTRAQ技术在产前标志物筛查应用的可行性。本研究应用iTRAQ技术结合串联质谱技术比较CHD孕妇与正常孕妇外周血中的蛋白表达差异，筛选孕妇血清中CHD相关标志物，并对这些蛋白标志物进行生物信息学分析，揭示其在CHD胚胎发育过程中可能的作用与价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料及分组

选取2011年9月至2014年12月中国医科大学附属盛京医院产前诊断中心40例诊断为胎儿单纯CHD孕妇外周血血清（CHD组），其中胎儿法洛氏四联征（tetralogy of Fallot，TOF）10例，室间隔缺损（ventricular septal defects，VSD）10例，共同动脉干（persistent truncus arteriosus，PTA）10例，其他少见先天性心脏畸形（mix of other rare CHD，MIX）10例（单心室、左心发育不良、心内膜垫缺损、主动脉瓣狭窄、心脏横纹肌瘤各2例）。选取10例周龄、孕妇年龄与CHD组相匹配的正常孕妇志愿者外周血血清（正常对照组）为对照。

所有孕妇均为单胎妊娠（不包含辅助生殖技术妊娠），孕22～26周，既往身体健康状况良好，不合并妊娠高血压、糖尿病、免疫系统疾病，孕期无特殊药物服用。于清晨空腹抽取静脉血5 mL，4℃静置1 h，3 000 r/min离心10 min后取上清，-80℃保存。本研究获得本单位伦理委员会批准，孕妇均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质提取与高丰度蛋白去除：将每组10管样本等体积混合，用Proteo miner试剂盒去除血清高丰度蛋白，并采用Brandford方法进行蛋白定量。

1.2.2 iTRAQ标记：每个样品取蛋白100 μg，利用胰蛋白酶进行消化，然后按照说明书进行iTRAQ标记。TOF，标记113标签；VSD，标记114标签；PTA，标记116标签；MIX，标记117标签；正常对照组，标记119标签。

1.2.3 强阳离子交换器（strong cation exchanger，SCX）分离：采用岛津LC-20AB液相系统、分离柱为4.6×250 mm型号的Ultremex SCX柱对样品进行液相分离，经筛选得到20个组分。每个组分分别用StrataX除盐柱除盐，然后冷冻抽干。同样方法技术重复2次。

1.2.4 基于Triple TOF 5600的LC-ESI-MSMS分析：与质谱仪相结合的液相系统为nanoACQuity，包括Symmetry C18柱（规格5 μm，180 μm×20 mm）和BEH130 C18柱（规格1.7 μm，100 μm×100 mm）两部分。所用的流动相A液（水∶乙腈∶甲酸=98∶2∶0.1）和B液（水∶乙腈∶甲酸=2∶98∶0.1）中都加入一定比例的校正液（Thermo Fisher Scientific）。每次上样量为2.25 μg（9 μL），用A液以2 μL/min的流速进行洗脱15 min。然后用含5%B液的流动相以300 nL/min流速洗脱1 min，建立洗脱梯度。40 min内B液梯度线型从5%升至35%，再5 min从35%升至80%，然后80%持续洗脱5 min，最后2 min恢复柱料。同样方法技术重复2次。

使用的机器为TripleTOF 5600（AB SCIEX，Concord，ON），离子源为NanosprayⅢsource（AB SCIEX，Concord，ON），放射器为石英材料拉制的喷针（New Objectives，Woburn，MA）。数据采集时，机器的参数设置如下：离子源喷雾电压2.5 kV，氮气压力为30 psi（14.5 psi≈1 bar），喷雾气压15 psi，喷雾接口处温度150℃；扫描模式为反射模式，分辨率≥30 000；积累250 ms的从2+到5+的离子挑选其中强度每秒积累超过120分的前30个进行扫描，3.3 s为1个循环；第2个四极杆（Q2）的传输窗口设置为100 Da为100%；脉冲射频电的频率为11 kHz；检测器的检测频率为40 GHz；每次扫描的粒子信号以4个通道分别记录共4次后合并转化成数据；对于iTRAQ类项目，离子碎裂的能量设置为（35±5）eV；母离子动态排除设置为：在50%的出峰时间内（约18 s），相同母离子的碎裂不超过2次。

1.3 生物信息学分析

使用数据库搜索软件将处理后得到的数据通过Mascot检索软件（MASCOT T2.3.02）检索。通过检索Gene Ontology数据库和COG数据库，对鉴定出的所有蛋白进行GO功能注释和COG功能分析。

2 结果

2.1 鉴定得到差异蛋白

利用Mascot软件中的Scaffold算法对同位素峰面积计算，搜索数据库后完成对蛋白质的相对定量和鉴定。最终在孕妇外周血血清中鉴定到二级谱图2 816 076个，匹配到特有肽段的谱图数量12 050个，鉴定到特有肽段序列2 549个，相应得到蛋白质606个。606个蛋白质中差异倍数达到1.5倍以上的蛋白47个，其中23个在CHD组中上调，24个在CHD组中下调，差异蛋白信息见表1。这47种差异蛋白质，部分在4组亚型CHD中均差异表达，部分在一组或几组不同亚型CHD中差异表达（图1）。

2.2 生物信息学分析

2.2.1 GO注释：按照功能进行分类差异蛋白主要涉及到细胞进程（16.67%）、应激反应（12.96%）、单有机体过程（12.96%）、代谢过程（9.26%）、生物功能调节（5.56%）、发育过程（5.56%）、信号转导（3.7%）等，提示了孕妇血清里蛋白含量的复杂性。见图2。

2.2.2 COG注释：经过COG注释分析，发现差异蛋白所占比例最大的为细胞骨架蛋白，所占比例达到26.67%，见图3。

3 讨论

CHD作为最常见的出生缺陷，其诊断与发生机制的研究一直是国内外学者普遍关注的。然而，在产前，CHD的诊断主要依靠超声心动图检查［2］，鉴于超声心动图对操作者技术要求较高，而且诊断时间较晚，在临床应用过程中受到一定限制。

图1 差异蛋白表达交集图Fig.1 Venn diagram of the differentially expressed serum proteins

在孕妇的外周血中筛选出畸形相关标志物目前公认为是产前诊断的最理想方式。妊娠过程依赖于细胞内和细胞间一系列复杂的相互作用，这包括激素、黏附分子、生长因子以及免疫调节因子等。妊娠期间需要这些因子严密地保持复杂的平衡关系。当胎儿发育或妊娠过程出现异常时，这些物质在母体循环中的平衡可能会被打破，此时，相关标志物的确定将有助于疾病的发生及其严重程度的判断［11］。利用孕妇的外周血筛查畸形相关标志物是一种相对无创的产前诊断方法，它可以避免传统的有创产前诊断方法（羊水穿刺、脐血穿刺等）带来的风险，并且可以作为一种筛查手段在基层医院得以开展，而且这种检查手段有可能早期发现胎儿发育异常，这为早期临床决策、机制研究以及靶向治疗提供了重要依据。

近年来，蛋白质组学技术的不断进步使产前无创诊断逐渐成为可能。蛋白质组学通过对疾病状态下全蛋白表达水平变化的定性定量分析，鉴定与疾病特征及病理过程相关的蛋白质、进而发现新的可用于诊断、预后、治疗反应监测和靶向治疗的生物标志物。目前国内外将蛋白质组学技术应用于产前诊断的研究主要集中于对非整倍体畸形［4-6］、先兆子痫［12］的产前诊断，尚没有应用蛋白质组学技术对CHD产前诊断标志物筛查的报道。本研究成功应用iTRAQ技术在正常孕妇与CHD胎儿孕妇外周血中鉴定到606种蛋白质，其中47种蛋白质在两组间存在明显差异。在下调的24种差异蛋白中，26.67%是细胞骨架蛋白，包括LMNA、TPM4、VIM、TLN1、MYH9、ACTG1、KRT9和FLNA。这些结构蛋白是胚胎发育所必需的，在细胞间物质转运过程中发挥了重要作用，而且已有文献报道LMNA［13］、TPM4［14］、MYH9［15］和FLNA［16］几种蛋白质与某些心脏疾病发生或胎儿发育过程相关。上调的23种蛋白质主要参与脂类代谢、应激反应、免疫反应等生物过程。这与之前的研究［17］认为孕妇本身脂类代谢异常会使胎儿发生CHD的概率升高相符合。其中，5种差异蛋白（TPM4、APOC1、SAA2、SAA4、PF4V1）在4组亚型CHD中均差异表达，提示这些蛋白很有可能参与了多种CHD的发生，而其他42种蛋白在一组或几组不同亚型CHD中差异表达，也体现了在不同亚型CHD的发生中存在不同分子机制的参与。

表1 经iTRAQ技术鉴定得到的差异蛋白质Tab.1 Differentially expressed proteins identified by using iTRAQ analysis

图2 GO分类图（参与生物学功能）Fig.2 GO annotation based on their biological functions

图3 COG分类图Fig.3 COG annotation

本研究成功利用蛋白质组学技术和多种生物信息学技术对CHD胎儿孕妇血清的差异蛋白进行了鉴定和生物学功能分析，结果表明CHD的发生过程中有多种蛋白质参与，而这些蛋白质在CHD发生中的具体机制需要进一步研究确定。

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（编辑 武玉欣）

The Identification of Differentially Expressed Proteins in Maternal Serum of Fetuses with Congenital Heart Defects by Using the iTRAQ Technology

CHEN Lizhu1，MA Wei2，ZHANG Mo3，YUAN Zhengwei2

（1.Department of Ultrasound，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Key Laboratory of Health Ministry for Congenital Malformation，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；3.Department of Urology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To screen for serum protein differentially expressed between women whose fetuses had congenital heart defects（CHD）and women who had normal fetuses.MethodsSerum samples were collected from pregnant women whose fetuses had CHD and those whose fetuses had no CHD，including a CHD group of 40 women and a control group of 10 women.The CHD group included 4 subgroups as follows:tetralogy of Fallot，ventricular septal defects，persistent truncus arteriosus，and a mixture of relatively rare types of CHD（n=10 each）.Samples in the same group were pooled to obtain equal amounts of proteins，and the iTRAQ proteomic approach was used to identify and quantify the proteins differentially expressed among these groups.ResultsWe successfully identified 606 proteins，among which 47 showed at least a 1.5-fold difference between the CHD and control groups.Among the 47 proteins，23 and 24 were upregulated and downregulated，respectively.ConclusionSeveral proteins associated with CHD could be identified by using the iTRAQ proteomic approach，and various proteins were involved in the pathogenesis of CHD in this study.

isobaric tag for relative and absolute quantitation；congenital heart defect；proteomics；serum biomarker；prenatal diagnosis

R541.1

A

0258-4646（2017）06-0510-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.007

国家自然科学基金青年基金项目（81600258）；国家重点研发计划（2016YFC1000505）；国家自然科学基金（81671469）

陈骊珠（1984-），女，讲师，博士.

袁正伟，E-mail：yuanzw@hotmail.com

2016-10-17

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