多巴酚丁胺联合顺铂对胃癌移植瘤YAP和p—YAP蛋白表达的影响

樊静华　高小云　郑绘霞　肖虹　武丽娜　梁钢　梁建芳

【摘要】 目的：通過建立胃癌移植瘤模型，观察多巴酚丁胺联合顺铂对胃癌移植瘤的生长抑制作用及对瘤体组织中YAP、p-YAP表达的影响。方法：采用人胃癌SGC-7901细胞株建立裸鼠皮下移植瘤模型，随机分为5组：空白对照（CK）组、阴性对照（NS）组、多巴酚丁胺（DOB）组、顺铂（DDP）组、联合用药（DOB+DDP）组。治疗结束后摘除移植瘤组织，测量并称重，计算抑瘤率。通过Western Blot检测YAP和p-YAP蛋白的表达。结果：治疗结束后CK、NS、DOB、DDP、DOB+DDP组瘤体终体积依次为（472.09±9.44）、（451.94±16.32）、（410.14±15.39）、（246.69±15.54）和（263.42±19.55）mm3。各组瘤质量分别为（0.84±0.02）、（0.82±0.04）、（0.65±0.03）、（0.35±0.01）和（0.35±0.02）g，其中实验组（DOB、DDP、DOB+DDP）抑瘤率分别为22.67%、58.71%和58.47%，与对照组（CK、NS）相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。DOB组和DDP组YAP表达量均低于对照组（P<0.05），p-YAP表达量高于对照组（CK、NS）（P<0.05），DOB+DDP组与对照组（CK、NS）相比差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：多巴酚丁胺可能通过下调YAP，同时上调p-YAP的表达抑制胃癌移植瘤生长，与顺铂联合抑制作用不明显。

【关键词】 胃癌； 多巴酚丁胺； 顺铂； YAP； p-YAP

Inhibitory Effect of Dobutamine Combined with Cisplatin on Gastric Implant Tumor and Expression of YAP and p-YAP/FAN Jing-hua，GAO Xiao-yun，ZHENG Hui-xia，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（14）：028-031

【Abstract】 Objective：To investigate the effects of Dobutamine combined with Cisplatin on the growth of human gastric tumor SGC-7901 cell xenografts in nude mice and the possible mechanisms involved in the expression of YAP and p-YAP.Method：The human gastric cancer SGC-7901 cell line subcutaneous transplantation tumor mode were randomly divided into 5 groups：Blank control（CK） group，Negative control（NS） group，Dobutamine（DOB） group，Cisplatin（DDP） group，Dobutamine+Cisplatin（DOB+DDP） group.After the treatment to remove the transplanted tumor tissue，tumor volume and weight were observed .The expression of YAP and p-YAP were evaluated by Western Blotting analysis.Result：Tumor volumes in CK group，NS group，DDP group，DOB group and DDP+DOB group were （472.09±9.44），（451.94±16.32），（410.14±15.39），（246.69±15.54） and （263.42±19.55）mm3.The quality of groups，respectively were （0.84±0.02），（0.82±0.04），（0.65±0.03），（0.35±0.01） and （0.35±0.02）g.Inhibitory rate of the experimental groups were 22.67%，58.71% and 58.47%，the differences were statistically significant compared with the control groups（P<0.05）.Compared with the control groups，YAP expressing quantity of the experimental groups was lower（P<0.05），p-YAP expressing quantity was higher（P<0.05）.Conclusion：Dobutamine may through cutting YAP and raising p-YAP expression inhibit the growth of gastric cancer xenografts in nude mice，while Cisplatin joint inhibitory effect is not obvious.

【Key words】 Gastric cancer； Dobutamine； Cisplatin； YAP； p-YAP

First-authors address：School of Basic Medical Sciences，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.14.008

《2014全球癌症报告》显示全球癌症发病形势十分严峻，其中胃癌年新增病例约为40.5万人，占世界新增病例的42.5%。目前进展期胃癌以手术联合化疗的综合治疗为主，但5年生存率仅为30%～50%[1]。有关专家指出基因靶向治疗和化疗联合能够提高化疗药物的选择性[2]。研究表明胃癌的发生与YAP基因表达异常之间存在相关性且YAP蛋白可调节肿瘤对化疗药物的敏感性[3]。前期实验发现多巴酚丁胺作用于YAP蛋白抑制胃癌SGC/7901细胞系的增殖、迁移能力[4]。本研究应用裸鼠移植瘤模型，观察多巴酚丁胺对胃癌移植瘤的抑制作用和传统化疗药顺铂的协同作用，为胃癌的治疗提供实验依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 人胃癌SGC-7901细胞购于中科院上海细胞库，BALB/C裸鼠购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司（合格证号SCXK湘2011-0003），雄性，4周龄左右，共28只，饲养于山西医科大学SPF级的动物饲养室。

1.2 主要试剂和药品 RPMI 1640培养基、胎牛血清（杭州四季青）；多巴酚丁胺（浙江瑞新药业）；顺铂（江苏豪森药业）；YAP多克隆抗体、p-YAP多克隆抗体（Cell Signaling）；（DAB显色试剂盒（北京中杉）。

1.3 裸鼠模型的建立及动物实验分组 将SGC-7901细胞置于胎牛血清培养基中培养，配置4.0×107个/mL的细胞悬液备用。取裸鼠于右季肋部皮下接种细胞悬液0.1 mL，肿瘤生长至直径约5 mm。剔除3只肿瘤直径未长至规定大小的裸鼠后，剩余的25只随机分为5组，每组5只：空白对照（CK）组：不作处理；阴性对照（NS）组：每日每次腹腔注射生理盐水；多巴酚丁胺（DOB）组：腹腔注射多巴酚丁胺（10 mg/kg，1次/d）[5]；顺铂（DDP）组：腹腔注射顺铂（2.5 mg/kg，隔日一次）[6]；联合用药（DOB+DDP）组：腹腔注射多巴酚丁胺10 mg/kg，

1次/d，隔日联合顺铂2.5 mg/kg。结束治疗后脱颈处死裸鼠，摘除移植瘤组织，称重并测量移植瘤长（a）、宽（b），按公式V（mm3）=ab2/2计算移植瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，并计算抑瘤率。抑瘤率=（空白对照组肿瘤质量-实验组肿瘤质量）/空白对照组肿瘤质量×100%。

1.4 Western blot检测YAP、p-YAP、GAPDH 称取瘤组织，反复研磨，加入RIPA裂解液，取相同体积的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，DAB法显色拍照。应用Image J图像分析软件进行灰度值分析，分别以YAP和p-YAP与GAPDH的比值作为目的蛋白的相对表达强度。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 移植瘤体积变化 各组移植瘤体积均随时间而增大，治疗结束后CK组终体积为（472.09±9.44）mm3，NS组终体积为（451.94±16.32）mm3，DOB组终体积为（410.14±15.39）mm3，NS组终体积为（246.69±15.54）mm3，DDP组终体积为（263.42±19.55）mm3，见图1。CK组和NS组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。DOB组、DDP组、DOB+DDP组裸鼠移植瘤体积较对照组（CK、NS）减小（P<0.05），其中DOB+DDP组体积抑制作用优于DOS组（P<0.05），但是与DDP组相比差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 裸鼠体重及瘤质量变化 治疗后DOB组、DDP组、DOB+DDP组移植瘤质量分别为（0.65±0.03）、（0.35±0.01）和（0.35±0.02）g，与对照组（CK、NS）相比差异均有统计学意义（P<0.05），其中DOB+DDP组比DOB组抑瘤率更强（P<0.05），见表1。

2.3 Western blotting检测结果 DOB组、DDP组YAP表达量均低于對照组（CK、NS）（P<0.05），p-YAP表达量高于对照组（CK、NS）（P<0.05）。（DOB+DDP）组与对照组（CK、NS）比较，差异无统计学意义（P>0.05），见图2、3。

3 讨论

多巴酚丁胺属于G蛋白偶联受体（GPCR）激动剂，临床上广泛用于治疗心肌梗死、心力衰竭等。然而除了传统的心血管作用外，有研究发现多巴酚丁胺在体外实验中能够抑制骨肉瘤细胞的生长[7-8]。本研究从裸鼠在体水平观察多巴酚丁胺和传统化疗药物顺铂对胃癌移植瘤的抑制作用。

YAP即Yes相关蛋白，由定位于染色体11q22的YAP基因编码，是Hippo信号通路中起关键作用的细胞内连接蛋白[9]。正常情况下YAP以磷酸化形式（p-YAP）积聚于胞质中，无转录激酶活性。一旦Hippo通路失活，活化后的YAP逐渐转入胞核，与转录因子TEAD相结合，进而激活下游基因的转录和表达[10]。有研究发现，胃腺癌患者中癌组织较非肿瘤性上皮组织YAP表达水平增高[11]，而且沉默YAP，能抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖和侵袭[12]。对胃癌患者的研究也发现YAP蛋白高表达患者生存率明显低于低表达者[13]。

近年很多学者发现，GPCR信号通路与Hippo-YAP通路密切相关[14-16]。Kim等[17]研究发现，多巴酚丁胺作用于GPCR配体促进Hippo-YAP的活动，同时Bao等[7]也发现多巴酚丁胺通过作用于肾上腺素受体能够诱导YAP磷酸化，使人骨肉瘤U20S细胞失去致癌活性。Fujii[18]也发现多巴酚丁胺可以抑制YAP介导的转录因子的活性，抑制YAP诱导的细胞生长。

从肿瘤生长曲线看出，用药第16天开始，单独使用10 mg/kg的多巴酚丁胺组移植瘤体积生长开始减慢，可见该剂量多巴酚丁胺对胃癌移植瘤具有潜在的抗肿瘤抑制效能，但生长曲线减缓趋势不太明显。顺铂组移植瘤体积增长明显减慢，表明传统化疗药物顺铂能够抑制胃癌移植瘤的增长。结束治疗后DDB组、DDP组和DOB+DDP组抑瘤率分别为22.67%、58.71%和58.47%，基本与肿瘤体积的抑制结果符合。本次实验的蛋白分析结果发现DOB组YAP含量降低同时p-YAP含量增加，说明多巴酚丁胺可能通过作用于YAP基因，增强YAP的磷酸化水平来抑制胃癌移植瘤的生长，与Cravo等[19]的研究结果相符。DDP组YAP下调、p-YAP上调，是因为顺铂作为一种广谱抗癌药物，在DNA损伤下，YAP被磷酸化，p-YAP作为促凋亡因子调节下游靶基因的表达[20]。本实验中DOB+DDP组与DDP组相比，差异无统计学意义（P>0.05），说明顺铂与多巴酚丁胺联合时可能并不能增强顺铂的作用，也可能与本实验中联合使用的频率、疗程、药物作用方式等有关，而且许多研究也强调Hippo-YAP调控具有复杂性。

综上所述，多巴酚丁胺对胃癌移植瘤具有一定的生长抑制作用，其抑瘤作用可能Hippo-YAP通路有关，但与顺铂联合作用的具体机制待进一步研究。

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（收稿日期：2017-01-18） （本文編辑：程旭然）