γ-干扰素释放试验在结核诊断中的价值

田瑞雪，马丽萍，武红莉，侯洪艳，张丽萍

(1.北京大学第三医院海淀院区北京海淀医院 呼吸科，北京 100086; 2.首都医科大学附属北京胸科医院 结核二病区，北京 101149)

·论著·

γ-干扰素释放试验在结核诊断中的价值

田瑞雪1，马丽萍2，武红莉1，侯洪艳1，张丽萍1

(1.北京大学第三医院海淀院区北京海淀医院 呼吸科，北京 100086; 2.首都医科大学附属北京胸科医院 结核二病区，北京 101149)

目的 评价γ-干扰素释放试验的酶联免疫斑点技术法(T-SPOT.TB)在结核病辅助诊断中的价值。方法 选择活动性结核病患者130例(包括肺结核112例，肺外结核8例)，陈旧肺结核患者89例，非结核呼吸系统疾病患者137例。所有患者在抗结核之前均进行痰液抗酸杆菌涂片及T-SPOT.TB检测。按照痰液抗酸杆菌涂片结果，将肺结核患者分为涂片阳性组和阴性组。按照年龄分为中青年组和老年组。比较T-SPOT.TB对活动性结核病、陈旧肺结核诊断效能。结果T-SPOT.TB诊断结核病的敏感度为82.307%，特异度为75.182%;T-SPOT.TB对活动性结核病，陈旧肺结核，非结核的诊断比较差异有统计学意义(χ2=7.580，P=0.032)；陈旧肺结核组阳性率比非结核组明显升高。肺结核T-SPOT.TB敏感度为86.60%，特异度75.00%，痰涂片检测的敏感度为65.17%，特异度98.33%。二者敏感度和特异度比较差异有统计学意义(P<0.001)。中青年T-SPOT.TB诊断的敏感度高于老年(χ2=4.782，P=0.029)。结论T-SPOT.TB检测快速便捷，有着较高的敏感度和特异度，可用于结核病尤其是涂阴性肺结核。对陈旧结核阳性率高，不适合鉴别陈旧肺结核和活动性结核。

结核，肺；干扰素γ；酶联免疫斑点测定

近年来建立和发展起来的γ-干扰素释放试验(interferongammareleaseassays，IGRAs)为结核病的早期快速诊断提供了新途径。IGRAs可弥补结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)试验的不足，目前多个国家已将其用于诊断结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染(LTBI)[1]。国内外研究结果表明IGRAs诊断活动性结核病，具有一定的辅助诊断价值，尤其在发达国家[2]。本研究回顾性分析经IGRAs的酶联免疫斑点技术法(T-SPOT.TB)方法检测的130例活动结核病及89例陈旧性肺结核临床资料，旨在评价T-SPOT.TB在活动性结核病诊断中的临床应用价值。探讨IGRA在陈旧性肺结核、痰涂片阳性、阴性和不同年龄结核病辅助诊断中的价值，结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 病例选择 回顾性分析2015年6月至2016年6月首都医科大学附属北京胸科医院、北京海淀医院收治的确诊结核患者130例，男77例，女53例，平均年龄(49.0±17.54)岁，其中肺结核112例(痰涂片菌阳性肺结核73例，痰涂片菌阴肺结核39例)，肺外结核18例；入选标准：所有病例均无结核病史，在抗结核治疗前行T-SPOT.TB检测；涂片抗酸杆菌阳性，MTB培养阳性，病理结果提示肉芽肿性炎伴凝固性坏死。符合典型结核病临床及影像学表现，但未获得病原学及病理学证实，疑似结核病患者经诊断经抗结核治疗治愈随访观察，临床可排除其他非结核性疾病。陈旧肺结核组89例，男51例，女38例，平均年龄(53.0±18.52)岁，患者X线或CT表现为陈旧肺结核表现纤维化病变和钙化。疾病对照为非结核组137例，来自北京市海淀医院，男82例，女55例，平均年龄(57.0±14.37)岁: 病理结果明确为肿瘤、炎症或其他疾病，且排除结核感染、陈旧肺结核、艾滋病毒感染等临床诊断为其他疾病的患者，经相应治疗或随访排除MTB感染，患者随访1年。

1.2T-SPOT.TB检测 使用结核感染T细胞检测试剂盒(免疫斑点法，英国OxfordImmunotec公司，批号：TEC009156)进行检测，结果判定标准：①空白对照孔斑点数为0～5个时，任何1个检测孔斑点数减去空白对照孔斑点数>6判定为阳性；②空白对照孔斑点数≥6时，任何1个检测孔斑点数≥2倍空白对照孔斑点数判定为阳性。

1.3 痰涂片抗酸染色方法 痰标本采集：痰液留取参照中国防痨协会《结核病诊断细菌学检验规程》，无痰患者可采取雾化引痰或通过纤维支气管镜取痰，痰液不合格者，需进一步指导后重新留取标本送检。痰涂片镜检：痰涂片按照《痰涂镜检标准化操作及质量保证手册》的要求处理，采用萋-尼染色法镜检。

1.4 统计学方法 应用SPSS20.0进行统计学分析。组间率的比较采用χ2检验，采用诊断性试验四格表计算敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1T-SPOT.TB对结核病的检测 130例确诊结核及137例非结核病例进行T-SPOT.TB检测，结果显示T-SPOT.TB对结核诊断的敏感度为82.307%，特异度为75.182%。见表1 。

表1 T-SPOT.TB对结核诊断结果(%)

2.2T-SPOT.TB对活动性结核病例、陈旧肺结核检测 各组阳性率比较差异有统计学意义，与非结核组比较，活动性结核组及陈旧肺结核组阳性率明显增高。见表2。

表2 T-SPOT.TB 在活动性结核和陈旧肺结核结果比较[例(%)]

注：χ2=7.580，P=0.032；与非结核组比较，P<0.05

2.3 活动性肺结核痰涂片和T-SPOT诊断比较 在诊断(包括确诊和临床诊断)为活动性肺结核病的112例患者中，73例经病原学证实为痰涂片菌阳性结核病，T-SPOT.TB检测敏感度高于痰涂片，特异度低于痰涂片。见表3。

表3 痰涂片和T-SPOT.TB对肺结核诊断比较(%)

2.4 不同年龄T-SPOT.TB检测 中青组(18～59岁)确诊肺结核病例88例，非结核组病例86例，老年组(60～89岁)确诊肺结核病例42例，非结核组51例，中青年组T-SPOT.TB检测敏感度高于老年组。见表4。

表4 不同年龄结核感染T-SPOT.TB检测结果比较(%)

2.5T-SPOT.TB诊断活动性肺结核 在诊断(包括确诊和临床诊断)为活动性肺结核的112例中，73例经病原学证实为痰涂片菌阳性结核病，其余39例为菌阴性结核病。T-SPOT.TB对菌阳和菌阴结核病检测的敏感度及特异度比较差异无统计学意义。见表5。

表5 T-SPOT.TB诊断活动性肺结核比较(%)

3 讨 论

结核病被列为我国重大传染病之一，是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病，仅活动性结核病患病率就高达459/10万，且无症状肺结核患者比例明显增加[3]。IGRAs作为一种快速、无创的诊断方法，是否可作为活动性结核的辅助诊断方法。尤其在我国这样结核高感染、高发病率的国家，是否有对活动性结核病的辅助诊断意义尚不清楚[4]。目前国内需要更加广泛的应用和评价。

IGRAs采用MTB的RDl区基因编码抗原多肽作为特异性抗原，抗原成分主要有相对分子质量为6 000的早期分泌抗原靶(ESAT-6)和相对分子质量为10 000的培养滤液蛋白(CFP-10)抗原或抗原多肽，ESAT-6、CFP-l0抗原的蛋白编码来源于MTB基因中的一个菌种特异性基因片段RD-1，而所有的BCG菌株和绝大多数非MTB(堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌和苏尔加分枝杆菌除外)不含RD-1，因此该试验有着较高的特异度，且不受是否接种卡介苗的影响。国外文献报道，T-SPOT.TB在中/低收入国家诊断肺结核的综合敏感度为82%～91%，特异度为61%～74%[5-6]。国内多数研究结果提示，T-SPOT.TB检测对疑似肺结核的诊断敏感度为77%～95%，特异度为65.5%～85%[7-9]。本研究选择了130例活动性结核患者，另选择137例非结核患者作为对照。结果表明T-SPOT.TB检测活动性结核病的敏感度和特异度为82.307%和75.182%，与文献报道结果相似。本研究显示在结核病高负担，卡介苗广泛接种的国家，IGRAs有较好的敏感度和特异度可以作为结核病辅助诊断手段。

IGRAs在陈旧肺结核患者中具体阳性率并不十分清楚，本研究探讨IGRAs能否区别陈旧性肺结核和活动性结核，结果显示IGRAs在陈旧肺结核阳性率51.69%，明显高于非结核组，IGRAs在陈旧肺结核高阳性率与相关研究一致[10]。IGRAs在陈旧肺结核诊断的阳性率及假阳性率升高，导致陈旧肺结核误诊为活动性肺结核比例升高，故T-SPOT.TB不能很好区分陈旧肺结核和活动性肺结核。杨新婷等[11]应用ESAT-6和ESAT-6/CFP-10抗原刺激后，分泌IFN-γ量在菌阴性肺结核组和陈旧性肺结核组之间比较差异无统计学意义。只有ESAT-6/CFP-10抗原刺激后，分泌IFN-γ的量在菌阳性肺结核组和陈旧性肺结核组之间差异有统计学意义。说明在陈旧肺结核因感染过MTB，体内MTB特异的记忆T淋巴细胞，在体外再次受到MTB特异抗原的刺激时，会释放分泌IFN-γ。在结核病高发国家，T-SPOT.TB在陈旧肺结核和结核潜伏感染阳性率是一致的[12]。故T-SPOT.TB无法区分陈旧肺结核与LTBI。陈旧肺结核阳性率较活动性结核病减低，主要因为参与结核细胞免疫应答的因子IFN-γ、TNF-p及IL4随着病情的好转显著降低，随着人体大量MTB被清除或者进入休眠状态后，人体免疫应答水平可能相应降低。因此，32%～46%活动性肺结核患者在抗结核治疗后检测IGRAs转阴性，阳性率下降[13-14]。所以在结核高发国家，应用IGRAs辅助诊断活动性肺结核，注意排除陈旧肺结核假阳性干扰。

本研究中以临床诊断结核病为标准，T-SPOT.TB对肺结核检测的敏感度高于痰涂片；T-SPOT.TB检测的特异度低于痰涂片。由此可见，在肺结核诊断上，T-SPOT.TB检测较痰涂片有着更高的敏感度。由于结核病是乙类传染性疾病，应早期发现，早期隔离，减少疾病的传播。与有症状的结核患者接触及接触时间是LTBI的危险因素，及时治疗和隔离有症状的结核病患者可有效降低密切接触者LTBI风险[15]。Anderson等[16]研究发现对结核患者及时治疗与隔离是减少结核病播散的最好手段。T-SPOT.TB作为高敏感度的诊断辅助实验避免临床工作漏诊结核病，减少结核病传播有重大的意义。

与痰涂片比较T-SPOT.TB特异度降低主要原因可能为：IGRAs是基于检测以MTB特异性抗原在体外刺激T细胞产生IFN-γ的原理为基础的体外免疫诊断技术，判断的是受检宿主T细胞是否对MTB特异性抗原有记忆，因此其临床意义为检测机体是否感染过MTB。机体的免疫系统启动了对MTB蛋白的免疫应答反应，对MTB产生了相应的记忆T细胞，当再次接触相同蛋白(抗原)时，即会产生和释放IFN-γ，IGRAs检测呈现阳性结果。我国是结核病高负担国家，2010年第五次全国结核病流行病学抽样调查结果显示，我国结核病患病率为459/10万[17]，但我国感染MTB的人数却超过5亿，占总人口的44.5%，其中绝大多数是LTBI者[18]。当患者机体隐性感染时，免疫系统启动了对MTB蛋白的免疫应答反应，故此我国特异度降低。痰涂片的高特异度，可以弥补T-SPOT.TB的低特异度，避免误诊。所以肺结核作为传染性疾病，T-SPOT.TB高敏感度的诊断技术可以提高疾病诊断效率，减低漏诊率。结核患者选择全血IGRA辅助诊断结核病有着更高的价值，建议临床推广。

我国肺结核患者中老年患者比例高，且随着年龄增加逐步增高，75～79岁达到高峰[17]。本研究中，T-SPOT.TB对老年肺结核病例的诊断敏感度78.57%，显著低于中青年。提示在中青年人群中T-SPOT.TB具有较好的辅助诊断价值，在老年人群中诊断性能相对降低。Bae等[19]采用QuantiFERON-TBGoldIT试验(QFT-GIT)和T-SPOT.TB两种IGRA试验方法检测结核患者，研究发现低于29岁的患者QFT-GITT和SPOT.TB敏感度为93.3%和96.7%，70岁患者敏感度降为68.3%和86%。进行多因素分析发现，GFT-GIT敏感度与年龄有相关性，T-SPOT.TB与年龄并无明显的相关性。可见随着年龄增加，IGRA检测敏感度下降，诊断效能降低。老年结核患者发病无典型症状，无症状者占28.7%。细菌学诊断结核病面临诸多问题，老年肺结核患者痰涂片阳性率仅占31.9%～68.1%，而且不耐受创伤性检测，确诊率低。胸片辅助检查不特异，PPD多呈一般阳性或阴性，强阳性仅占19.3%[20]。而吴研等[21]研究408例老年肺结核患者T-SPOT.TB检测阳性检出率高于痰涂片、痰培养和结核抗体检测的阳性率，T-SPOT.TB诊断敏感度较其他检查方法高，对于老年IGRAs的检测结果应该谨慎解读，需结合临床症状和其他检测结果综合诊断。老年患者IGRAs检测敏感度下降，可能与老年病例的免疫力下降、营养不良、合并症增多等有关。随着年龄的增长，机体免疫力逐渐下降，对结核抗原的应答能力也趋于下降，因此表现为结核抗原刺激后释放IFN-γ的斑点数降低，甚至不反应[22-23]。

在涂阳肺结核患者中，全血IGRA检测阳性率为94.52%；而在涂阴患者中，全血IGRA检测阳性率为74.35%，而差异无统计学意义。与相关研究一致[24]。提示全血IGRA检测可以将有助病原学阴性肺结核的诊断。

综上所述，T-SPOT.TB检测在临床上可以作为结核病辅助诊断手段，敏感度提高有利于结核病诊断，避免漏诊传染源，不能区分陈旧肺结核与活动性结核病。对中青年疑似结核病病例具有更加突出的辅助诊断能力。对病原学阴性结核病提高诊断率。

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DiagnosticvalueofT-SPOT.TBinterferon-γreleaseassayfortuberculosis

TianRuixue1，MaLiping2，WuHongli1，HouHongyan1，ZhangLiping1

1.DepartmentofRespiratoryMedicine，BeijingHaidianHospital，BeijngHaidianSectionofPekingUniversityThirdHospital，Beijing10080，China; 2.SecondWardofTuberculosis，BeijingChestHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing101149，China

TianRuixue，Email：tianruixue2009@163.com

ObjectiveToevaluatethevalueofinterferon-gammareleaseassay(IGRA)indiagnosisoftuberculosis.MethodsThestudyrecruited130casesofactivetuberculosisclinicallyprovedfromBeijingChestHospital，and89casesofoldhealedtuberculosisand137casesofnon-TBpatientsfromBeijingHaidianHospital.T-SPOT.TBtestandfluorescencestainingbeforeanti-tuberculosistherapywereperformedinallpatients．Accordingtotheresultofthefluorescencestaining，thepatientswithtuberculosisweredividedintopositivegroupandnegativegroup.Accordingtotheage，thepatientsweredividedintoyoungergroupandelderlygroup.ThediagnosticperformanceofT-SPOT.TBwascompared.ResultsThesensitivityofthetuberculosisfromT-SPOT.TBdiagnosiswas82.307%，thespecificitywas75.182%.ThepositiveratesofT-SPOT.TBamongpulmonarytuberculosis，oldhealedtuberculosisandnon-TBpatientsweresignificantlydifferent(χ2=7.580，P=0.032).ThepositiverateofT-SPOT.TBinoldhealedtuberculosiswassignificantlyhigherthanthatofnon-TBpatients.Thesensitivityofpulmonarytuberculosiswas86.60%，thespecificityofT-SPOT.TBwas75.0%，thesensitivityofthefluorescencestainingwas65.17%，thespecificityofthefluorescencestainingwas98.33%.Thecomparisonbetweenthetworesultshadremarkablestatisticalsignificance(P<0.001).Thesensitivityoftheyoungergroupwasobviouslyhigherthanthatoftheeldergroup(χ2=4.782，P=0.029).ConclusionT-SPOT.TBismorequickandconvenient.Italsohasahighersensitivityandnegativepredictedvalue.T-SPOT.TBisamorevaluableauxiliarydiagnosistoyoungerpatients.Itcanbeusedinthediagnosisofsmearnegativepulmonarytuberculosispatientsandisnotrecommendedinidentifyingoldhealedtuberculosisandactivetuberculosis.

tuberculosis，pulmonary；interferon-gamma；enzyme-linkedimmunospotassay

田瑞雪，Email:tianruixue2009@163.com

R

A

1004-583X(2017)06-0507-05

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.06.014

2017-03-08 编辑:王秋红