四氯化碳制备肝硬化腹水模型方案的分析与比较

戴瑶瑶, 范兴良, 祝峻峰

上海中医药大学附属市中医医院肝病科, 上海 201203

四氯化碳制备肝硬化腹水模型方案的分析与比较

戴瑶瑶, 范兴良, 祝峻峰

上海中医药大学附属市中医医院肝病科, 上海 201203

四氯化碳(CCl4)是制备肝硬化腹水模型的经典造模方案。本文从不同给药途径和不同造模方案概述和评析以CCl4为主制备肝硬化腹水模型的方案，分析每种造模方案的优劣势，总结较优制备模型方案，为实验研究提供参考，同时也为深入研究肝硬化腹水奠定基础。

肝硬化腹水；四氯化碳；动物模型

腹水是肝硬化最常见、最早发生的并发症之一。研究[1]表明，代偿期肝硬化患者10年内约有50%进展为腹水，与无腹水形成的肝硬化失代偿期患者相比，有腹水形成的患者死亡率明显升高，50%的腹水患者在5年内死亡[2]。构建能够模拟人肝硬化腹水过程的理想动物模型是探索疾病早期诊断、寻找及时有效治疗、改善病情和预后的关键。目前有四氯化碳(CCl4)造模法、乙醇造模法及免疫造模法等肝硬化动物模型制备方法[3]。CCl4造模法是经典的肝硬化腹水制备模型方法，广泛应用于动物模型肝毒性研究[4]。随着研究的深入，CCl4制备肝硬化腹水模型的方案得到不断优化。综合文献报道，发现各造模方法比较集中的问题主要是给药方式、药物浓度、时间及造模后持续时间尚未确定，现将近年来以CCl4为主不同造模方法的优缺点作一比较，并对该领域的前景作一概述。

1 不同给药途径比较

CCl4制备肝硬化腹水模型的主要给药途径包括灌胃、皮下注射、腹腔注射、吸入等。实验人员通过长期探索研究，相互比较，对造模给药途径各有看法，概述如下。

腹腔注射具有操作简便、动物吸收快、肝药物浓度高、成模时间短、毒副反应降低等优点，死亡率为20%～35%[5]。崔承虎等[6]采用大鼠肝硬化疾病评分模型(SLCD)和拉埃内克纤维化评分系统(LFSS)测得生化和组织形态学分值。结果显示：腹腔注射给药肝硬化模型效果优于皮下注射和灌胃方法。大鼠死亡率腹腔注射、皮下注射、灌胃依次升高。但CCl4腹腔注射容易导致腹腔粘连而无法正确评估腹水[7]。皮下注射是经典的造模给药方式，可以缩短造模时间[8]，但注射后很快被机体吸收进入循环系统，脑、肾毒性较大，并且注射部位容易发生浸润性脓肿和溃疡，死亡率为30%～40%[9]。吸入法可缩短造模时间，但呼吸道刺激大，动物很难耐受，中枢毒性大。灌胃法CCl4可直接吸收入肝，但操作复杂，肠道反应大[10]。

肝硬化腹水模型制备的给药途径无统一言论。不同给药方式与动物模型肝硬化严重程度及动物死亡率存在一定相关性，造模给药方式各有优劣，具体选择何种给药途径，实验人员应根据具体情况酌情选择。

2 CCl4制备模型不同方法

2.1 单用CCl4制备法CCl4是一种有效的致肝坏死的肝毒素剂，广泛用于动物模型诱导的急性和慢性肝损伤[11]。CCl4导致实验动物模型肝损伤的最主要原因是氧化应激反应。通过细胞色素P450介导活化引起的实验性肝损伤的自由基[12]，如三氯甲基和三氯甲基过氧化氢，影响肝细胞的细胞膜导致结构和功能发生改变[13]，纤维结缔组织明显增生，形成肝纤维化，进一步发展为肝硬化[14]。单纯使用CCl4肝毒性剧烈，剂量不同直接影响动物模型的死亡率。低剂量CCl4导致Ca2+释放、膜损伤、凋亡、再生；中剂量则导致脂变、纤维化、硬化甚至癌变；高剂量则直接造成肝细胞坏死，出现肝衰竭；极限量CCl4将会对多种脏器损伤，出现中枢抑制、呼吸衰竭甚至死亡[15]。所以单纯注射CCl4剂量把握很重要。同时单独注射CCl4还存在给药时间长、成模率低、死亡率高等问题，但是单纯注射CCl4造模方法简单，病变典型(见表1)。

表1 单用CCl4制备法

Tab 1 Single use CCl4in method of preparation

动物品种动物体质量(g)造模方式 造模时间成模率(%)死亡率(%)参考文献Wistar大鼠180～20050%的CCl4橄榄油溶液2ml/kg皮下注射(首次3ml/kg皮下注射)2次/周,共12周5050[16]SD大鼠180～20050%的CCl4橄榄油溶液3ml/kg皮下注射(首次6ml/kg皮下注射)2次/周,共12周48.151.9[17]SD大鼠180～22060%的CCl4橄榄油溶液3ml/g腹腔注射3次/周,共12周7227[18]SD大鼠180±2050%的CCl4橄榄油溶液3ml/g皮下注射2次/周,共16周52/[19]

表2 CCl4联合苯巴比妥制备法

Tab 2 CCl4combined with Phenobarbital in method of preparation

动物品种动物体质量(g)造模方式造模时间成模率(%)死亡率(%)参考文献Wistar大鼠150～18035%苯巴比妥单独为饮用水2周,后以80μlCCl4溶液灌胃,根据体质量变化改变剂量。后继以35%苯巴比妥饮用水和CCl4联合管理直至腹水形成1次/周,共10～18周96.43.6[24]SD大鼠/35%苯巴比妥溶液为饮用水。初始剂量为20μlCCl4溶液灌胃,以后每次剂量变化根据48h内动物体质量变化予以相应调整,发展成腹水后剂量减小到40μl1次/周,共12周59.340.7[25]SD大鼠100～15035%苯巴比妥溶液作为饮用水2周,在乙醚麻醉下插胃管,起始剂量40%CCl4油溶液按40μl,按体质量个体化增加至400μl1次/周,共10周78.626.3[26]SD大鼠200±2035%苯巴比妥溶液作为饮用水1周,按1ml/kg腹腔注射,首剂加倍,第2～3周10%CCl4油溶液,第4～5周12%CCl4油溶液,第6～7周14%CCl4油溶液,第8～9周给予16%CCl4油溶液,第10～11周给予18%CCl4油溶液,第12～14周给予20%CCl4油溶液2次/周,共14周90.010.0[27]

2.3 CCl4联合乙醇制备法乙醇是酶的诱导剂，可以加强CCl4的毒性[28]，乙醇代谢的主要场所在肝脏，乙醇在肝内经代谢产生乙醛，后者能与蛋白质结合干扰正常的代谢从而产生直接细胞毒性作用。同时乙醇的氧化代谢影响细胞内的信号传导途径，扰乱了一些基因的转录调控，导致脂肪堆积、纤维化、激活先天免疫和适应性免疫[29]。长期的乙醇喂养，使得脂肪组织极低密度脂蛋白受体(VLDLR)明显衰减，从而使肝脏病变加重[30]。所以CCl4联合乙醇制备模型，可以减少造模时间。但是由于动物对乙醇饮用水的自然抵触情绪，容易导致脱水、低血液酒精浓度和营养不足等一些弊端[31]，致使部分大鼠因拒绝饮水而死亡。改良方案： CCl4和乙醇浓度逐步增加，使得动物可以有耐受的过程，降低死亡率。实验数据表明用食用白酒代替乙醇也使动物拒水的现象大大减少(见表3)。

表3 CCl4联合乙醇制备法

Tab 3 CCl4combined with Ethanol in method of preparation

动物品种动物体质量(g)造模方式造模时间成模率(%)死亡率(%)参考文献Wistar大鼠240～26010%乙醇作为大鼠唯一用水,第1天3ml/kg皮下注射CCl4,后则予40%CCl4橄榄油溶液(1.5ml/kg)腹部皮下注射2次/周,共8周62.5/[32]Wistar大鼠150～20010%乙醇自来水溶液作为饮用水,50%CCl4橄榄油混合液(4ml/kg)腹腔注射。体质量降低≥10g时,暂停给药,并改用自来水为饮用水源,直到体质量恢复到<10g时继续上述方案2次/周,共10周72.527.5[33]Wistar大鼠160～20010%乙醇作为大鼠唯一用水,40%CCl4橄榄油混合液(2ml/kg)腹腔注射2次/周,共12周7525[34]SD大鼠200±2010%乙醇作为大鼠唯一用水,皮下注射50%CCl4植物油溶液,第1天按5ml/kg,从第3天起剂量改为3ml/kg3次/周,共11周71/[35]

2.4 综合方案制备法联合乙醇、苯巴比妥或是饮食营养的改变诱导模型。限制食物加重CCl4毒性是通过CCl4代谢活化导致，从而引起更严重的肝损伤[36]。然而限制食物对肝毒性的影响是有争议的，因为食物限制可以使CCl4的药物毒性在过氧化反应中最小化[37]。苯巴比妥和乙醇同时作用下加速CCl4导致肝细胞坏死，缩短造模时间，同时CCl4的给药剂量可以减少，从而使药物的毒副作用降低，减少死亡率[38](见表4)。

表4 综合方案制备法

Tab 4 Comprehensive method of preparation

动物品种动物体质量(g)造模方式造模时间成模率(%)死亡率(%)参考文献Wistar大鼠160～200饮水:第1～2周为30%苯巴比妥,第3周开始改为10%乙醇至实验结束。40%CCl4橄榄油混合液(2ml/kg)腹腔注射2次/周,共12周8020[34]Wistar大鼠250±20饮水:10%乙醇作为大鼠唯一用水,食物:79.5%玉米粉、20%猪油、0.5%胆固醇混合。注射40%CCl4植物油溶液,第1天按4ml/kg,从第3天起剂量改为2ml/kg2次/周,共10周86.713.3[39]SD大鼠240～260第1～6周饮水为10%乙醇,饮食为纯玉米粉中加入20%的猪油及0.5%的胆固醇。首次按50%的CCl4大豆油溶液(5ml/kg)皮下注射,以后的注射剂量根据前1周体质量增减幅度进行调整2次/周,共8周8515[40]SD大鼠250～300饮水:0.035%苯巴比妥诱导1周,第1～4周为10%乙醇。第5～8周改为20%乙醇。饮食:玉米面等高糖低蛋白饮食。第1～4周按40%的CCl4油溶液(3ml/kg)皮下注射,首剂加倍;第5～8周按50%的CCl4油溶液(3ml/kg)皮下注射2次/周,共8周83.33/[41]

3 讨论

综上所述，CCl4综合造模方案优于单纯CCl4方案，死亡率降低，大大缩短了造模时间，模型的稳定性更佳。仍存在如下问题：(1)肝硬化腹水的发生机制、疾病进程、转归等方面动物模型和人类有异。人类发病是一个复杂的病理过程，且具有种属差异，CCl4诱导的肝硬化与人类的肝硬化相比有很多相似但也有许多重要的差异，很难复制出同样的动物模型。理想的动物模型应与人类肝硬化、门脉高压的特征相同，但是目前尚无理想的动物模型能够满足，有待进一步实验研究[42]。(2)CCl4剂量难以掌握。动物本身个体差异明显，不同组别之间也具有差异，即使是近交系也存在此问题，1936年Cameron等[43]采用CCl4制备模型时就强调，依赖CCl4造成反复肝损伤必须局限在一个狭窄的临界范围。因其具有可逆性，一方面导致肝衰竭，另一方面导致动物死亡。解决此问题最有效的方法是监测动物体质量，个体化给药，在一定程度上可降低死亡率。(3)制备模型的实验方案在不断优化，但方案的进步只是相对而言，尚无一种实验方案可以有效降低死亡率，缩短造模时间，且有良好的稳定性、重复性，动物大量死亡不符合动物伦理学。CCl4具有挥发性，对人体有较大危害。因此，建立理想肝硬化腹水模型很困难，人和动物在种属、病因、生化及免疫性等方面的差异都应在考虑范围之内，实验者应根据具体实验需要选择造模方法。

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(责任编辑：王全楚)

Analysis and comparison of the model of cirrhosis ascites induced by carbon tetrachloride

DAI Yaoyao, FAN Xingliang, ZHU Junfeng

Department of liver Disease, Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

Carbon tetrachloride (CCl4) is the classic modeling scheme of preparation of liver cirrhosis ascites model. This paper reviewed the scheme of preparing liver cirrhosis ascites model mainly based on CCl4by different medicate on routes and modeling schemes, and analyzed the advantages and disadvantages of each modeling program. The better preparation modeling was summarized and reference for experimental research was provided, at the same time, the foundation for the further research of cirrhosis ascites was layed.

Liver cirrhosis ascites; Carbon tetrachloride; Animal models

上海市进一步加快中医药事业三年发展行动计划项目(ZY3-JSFC-1-1017)；海派基地建设(ZY3-CCCX-1-1001)

戴瑶瑶，在读硕士研究生，研究方向：慢性肝病的中医防治。E-mail: shzyydxdyy@163.com

祝峻峰，硕士，主任医师，研究方向：中西医结合治疗慢性肝病。E-mail: zhujftongling@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.01.002

R575.2

A

1006-5709(2017)01-0005-05

2016-05-30