不同pH值甲醛固定液对肾脏标本特殊染色的影响

2017-06-05朱小兰骆新兰张科平武鸿美

临床与实验病理学杂志 2017年4期

朱小兰，骆新兰，张科平，武鸿美，许洁

朱小兰，骆新兰，张科平，武鸿美，许洁

肾脏；甲醛；pH值；特殊染色

特殊染色是肾脏病理诊断不可缺少的依据，而特殊染色制片质量是否稳定直接影响到病理诊断的准确性、及时性。制片质量受多种因素影响，其中最关键的是肾脏组织光镜标本的固定，因此固定液的选择至关重要。本文将对配制的三种不同pH值的甲醛固定液用于肾脏组织光镜标本的固定情况进行比较，观察肾脏组织切片六胺银、Masson三色、高碘酸-无色品红等特殊染色的染色效果，找到肾脏组织固定效果最好的固定液配制方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂收集广东省人民医院2014年10月～2015年4月肾内科肾脏穿刺送检组织、外院肾脏穿刺送检组织切片共359例，其中男性238例，女性121例，年龄23～76岁，平均49岁。

1.2 仪器与设备 Shandon全自动密闭脱水机、Shandon Histocentre 3包埋机、Shandon MICROM HM340-E切片机、Shandon全自动封片机、10～100 ℃恒温烘干箱、标签打印机。

1.3 固定剂 A组：10%中性缓冲福尔马林；B组：10%酸性缓冲福尔马林；C组：10%碱性缓冲福尔马林。

1.4 固定液配制 10%中性缓冲福尔马林、10%酸性缓冲福尔马林、10%碱性缓冲福尔马林均为混合PBS-福尔马林固定液，pH值分别为7.0、6.0、9.0(取磷酸二氢钠4.0 g与磷酸氢二钠6.5 mg，加水溶解成900 mL溶液，再加40%甲醛100 mL配制而成，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节到pH值为6.0、7.0和9.0的固定液)。

1.5 方法

1.5.1 标本制备切取标本时，动作一定要轻，切勿挤压，避免人为破坏肾组织结构，且应在短时间内切取标本。将新鲜的肾脏标本沿肾门切开，取皮髓质交界处组织，按照取材大小(1.2 cm×0.5 cm×0.1 cm)切取4块，分别固定在4种预先配制好的固定液中。固定5 h后取出，当天下午5点半用全自动脱水机进行固定、脱水、透明、浸蜡等处理[1-2]。

1.5.2 方法 4组标本分别进行包埋、连续切片(厚1 μm)，依次裱片于3张载玻片上，进行Masson三色、六胺银、高碘酸-无色品红染色。上述三种特殊染色中的试剂配制和操作流程均按文献要求进行[3]。3张组织切片的Masson三色染色、3张组织切片的六胺银染色、3张组织切片的高碘酸-无色品红染色均在相同条件下进行，以保证结果客观、可信。

1.5.3 评定标准优：组织切片结构完整，颜色鲜艳，均匀一致，肾小球毛细血管、系膜细胞清晰，细胞无收缩；良：细胞相对清晰，有轻度收缩，形态发生一定改变，核着色分明；差：组织结构模糊，普遍有核溶解现象，胞质染色不清晰，色彩黯哑，染色对比度差。

2 结果

2.1 3组固定液对三种特殊染色切片质量效果比较通过镜下观察发现，10%中性缓冲福尔马林组，Masson三色法显示组织结构清晰，肾小管胞质和红细胞呈鲜红色，免疫复合物呈红色，胶原纤维、肾小球基膜、系膜呈绿色，细胞核呈蓝褐色。六胺银染色显示组织结构清晰：基膜着色深，背景清晰。高碘酸-无色品红染色显示组织结构清晰：基膜着色呈鲜红色，背景清晰；10%酸性缓冲福尔马林、10%碱性缓冲福尔马林2组固定液Masson三色法染色的结果：组织结构不清晰，有核溶解、核固缩现象，胞质染色不清晰，三色对比度差，染色对比度差。10%酸性缓冲福尔马林、10%碱性缓冲福尔马林2组固定液六胺银法、高碘酸-无色品红染色的结果：组织结构发生改变，有核溶解、核固缩现象，基膜着色深，背景较清晰(10%酸性缓冲福尔马林)，背景红染(10%碱性缓冲福尔马林)(表1，图1～3)。

表1 3组固定液对359例肾脏组织三种特殊染色镜下切片质量效果比较

2.2 3组固定液对三种特殊染色切片质量等级比较 10%中性缓冲福尔马林组：组织无明显收缩，平整度好，切片连续完整，染色优良率在95%以上；10%酸性缓冲福尔马林和10%碱性缓冲福尔马林2组固定液：肾组织结构均不清晰，有核溶解、核固缩现象，胞质染色不清晰，三种特殊染色的优良率仅12%～31%(表2)。

3 讨论

3.1 固定液的作用固定液的选择至关重要，理想的固定液要满足三点[4]：(1)渗透快，尽可能减少细胞自溶性变化；(2)不改变组织细胞原来生活状态时的形态，不产生人工假象和变形；(3)尽可能保持组织细胞内抗原活性，防止抗原弥散和丢失，因为固定液的pH值可直接影响渗透作用、渗透压、染色强度及背景染色。

3.2 中性固定液对肾脏穿刺组织的作用 10%中性缓冲福尔马林固定液可使新鲜组织中的蛋白质沉淀，细胞保存完好不被溶解，组织形态好，固定均匀，收缩少，既最大程度保存了组织结构的完整，有利于切薄片进行特殊染色，并使细胞内不同成分产生不同的折光率，对染料产生不同的亲和力，经染色后容易区分[5]。

①A①B①C②A②B②C③A③B③C

图1 A.10%中性缓冲福尔马林固定：肾组织结构清晰，肾小管胞质和红细胞呈鲜红色，胶原纤维、肾小球基膜、系膜、呈绿色，细胞核呈蓝褐色，三色对比清晰；B.10%酸性缓冲福尔马林固定：肾组织结构不清晰，肾小管胞质和红细胞颜色黯哑，核溶解呈空泡状，三色对比不鲜明；C.10%碱性缓冲福尔马林固定：肾组织结构不清晰，肾小管胞质和红细胞颜色深红，核溶解呈空泡状，三色对比差，Masson三色染色图2 A.10%中性缓冲福尔马林固定：肾组织结构清晰，基膜呈黑色，背景清晰；B.10%酸性缓冲福尔马林固定：肾组织结构欠清晰，基膜呈黑色，核溶解呈空泡状，背景清晰；C.10%碱性缓冲福尔马林固定：肾组织结构不清晰，细胞肿胀，基膜呈黑色，背景均质红染，六胺银染色图3 A.10%中性缓冲福尔马林固定：肾组织结构清晰，基膜呈鲜红色，背景清晰；B.10%酸性缓冲福尔马林固定：肾组织结构欠清晰，核溶解呈空泡状，基膜呈红色，背景清晰；C.10%碱性缓冲福尔马林固定：肾组织结构不清晰，细胞肿胀，基膜呈红色，核溶解呈空泡状，高碘酸-无色品红染色

表2 3组固定液对359例肾组织三种特殊染色切片质量等级比较[n(%)]

3.3 酸性固定液对肾脏穿刺组织的影响组织甲醛久存易致氧化产生甲酸而呈酸性，pH值的影响十分明显，在酸性环境下(-NH3)不能与水合甲醛发生反应，同时固定液放置一段时间后可发生重聚作用，而且重聚作用的速度取决于pH值，pH值低时聚合加快，使固定效果急剧下降[6]，肾组织结构发生改变，残缺，细胞变形、变位，溶液呈酸性，影响Masson三色染色中丽春红、亮绿染色，所制出的切片效果很差，难以诊断。

3.4 碱性固定液对肾脏穿刺组织的影响在pH>8.0的碱性固定液中，肾组织结构发生了改变，残缺，有核溶解现象，抗原物质被破坏，染色定位差，易产生染色背景，影响对肾小管毛细血管壁及系膜细胞的观察。3组固定液中以10%中性缓冲福尔马林对肾脏组织的固定效果最佳(表1、2)。

3.5 固定液的规范使用手术标本的无可替代性与不可重复性决定了固定液配制的重要性。由于固定液具有较强刺激性、毒性、腐蚀性，易挥发并对人体健康有危害，目前大多数医院都在使用商品化固定液，而甲醛久存则氧化产生甲酸而呈酸性，因此，病理科对临床科室应重点强调固定液的规范化和标准化。首先，要求商品化固定液的生产厂家必须三证(营业执照、生产许可证、卫生许可证)齐全。其次，要定期检查固定液的生产日期、有效期和固定液的pH值。最后，在标本送检方面，病理科应定期抽查临床科室送检标本固定液的有效期和pH值，将抽查结果详细统计并反馈给医务部门和临床科室，对于不符合要求的送检标本，应积极与临床科室沟通，强调标本固定的重要性，确保临床科室按要求将离体标本及时固定，并保证标本完全浸泡在固定液中，达到送检标本的规范化和标准化，降低医疗风险。

[1] 孟奎, 马恒辉, 石群立, 等. 病理制片质量控制[J]. 临床与实验病理学杂志, 2001,17(5):439-440.

[2] 杨枫. 影响HE染色细胞形态的因素控讨[J]. 临床与实验病理学杂志, 1999,15(4):361.

[3] 凌启波.实用病理特殊染色和组化技术[M]. 广州: 广东高等教育出版社, 1989:238-241.

[4] 杨美娟. 组织标本固定方法与免疫组织化学染色效果的关系[J]. 解剖科学进展, 2003,9(1):89-90.

[5] 全国卫生专业技术资格考试专家委员会. 病理学技术[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2013:261-262.

[6] 王伯沄, 李玉松, 黄高昇, 等. 病理学技术[M]. 北京：人民卫生出版社, 2000:67-70.

国家临床重点专科建设项目(S2013010014009)

广东省人民医院/广东省医学科学院病理医学部病理科，广州 510080

朱小兰，女，副主任技师。E-mail：zxlllp@163.com

时间：2017-4-17 18:19

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