涎腺腺样囊性癌组织中HPV感染及p53、p16、EGFR、Cdc2蛋白表达与预后的关系

孙玉满，吴 蒙，韩凤艳，刘宏侠，杨俊泉，汪宏斌

涎腺腺样囊性癌组织中HPV感染及p53、p16、EGFR、Cdc2蛋白表达与预后的关系

孙玉满1，吴 蒙2，韩凤艳1，刘宏侠1，杨俊泉3，汪宏斌3

目的 初步探讨HPV感染及p53、p16、EGFR及Cdc2表达与涎腺腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma, ACC)预后的关系。方法 收集76例涎腺ACC手术标本，分别采用PCR-DNA反向点杂交及免疫组化SP法检测肿瘤组织中HPV-DNA及p53、p16、EGFR及Cdc2表达，收集临床资料并随访。Kaplan-Meier模型分析患者生存情况，Log-rank检验比较生存曲线，多因素Cox回归模型进行预后分析。结果 涎腺ACC组织中HPV感染率为0(0/76)。p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白在肿瘤组织中的阳性率分别为76.3%(58/76)、57.9%(44/76)、60.5%(46/76)及64.5%(49/76)。p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、TNM分期及病理类型无关(P均>0.05)。EGFR阳性患者中位总生存期(overall survival, OS)低于阴性患者(χ2=19.111，P<0.01)。EGFR阳性患者中位无进展生存期(progression-free survival, PFS)低于阴性患者(χ2=6.621，P<0.01)。Cdc2阳性患者中位OS短于阴性患者(χ2=3.870，P<0.05)。Cdc2阳性患者中位PFS低于阴性患者(χ2=6.755，P<0.01)。多因素Cox回归模型分析显示EGFR、Cdc2蛋白表达(RR=13.417、13.075，P均<0.001)是涎腺ACC患者预后的独立危险因素。结论 涎腺ACC组织中未检测出HPV感染。p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白在涎腺ACC组织中呈不同程度表达，p16不能作为涎腺ACC患者HPV感染状态的替代指标。EGFR及Cdc2阳性表达是涎腺ACC患者预后的独立危险因素，临床对EGFR及Cdc2蛋白表达患者应密切随访。

涎腺肿瘤；腺样囊性癌；HPV；EGFR；Cdc2；预后

腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma, ACC)是一种好发于涎腺的恶性肿瘤，属头颈部恶性肿瘤中相对少见的一种类型。其在腮腺的发病率约为10%，小涎腺的发病率约为30%[1]。组织学上， ACC具有局部生长迅速，神经浸润、远处转移及复发率高的特点，临床治疗难度大。因此，探寻ACC复发和预后因素对肿瘤的治疗有一定的指导意义。近年来病毒感染已成为公认的引起人类头颈部肿瘤的发生因素，如人乳头状瘤病毒(human papilloma virus, HPV)和EB病毒等[2]。HPV感染可以在多个部位，如子宫颈、口腔可引起鳞状细胞肿瘤，而HPV在涎腺肿瘤的发生、发展过程中所起的作用仍值得商榷。本文旨在评价HPV感染与p16、p53、EGFR及Cdc2之间的关联以确定这些因素与涎腺ACC发生、发展及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集唐山市协和医院2004年1月1日～2013年12月31日手术切除的76例ACC组织，其中肿瘤位于腮腺者26例，颌下腺24例，腭部20例，舌下腺6例。临床资料较完整，所有切片均经两位高级职称病理医师复核。标本均完成HPV-DNA及p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白免疫组化检测。76例患者中，男性40例，女性36例；年龄41～70岁，中位年龄51岁；根据第6版AJCC标准进行临床分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期15例，Ⅲ期19例，Ⅳ期36例。组织学类型包括实体型、筛状型、管状型。

1.2 检测设备与试剂 PCR-DNA反向点杂交所用检测仪器及HPV基因分型检测试剂盒均购自深圳亚能生物公司。p53单抗Do-1、鼠抗人p16ink4单抗ABM51100-10、鼠抗人EGFR单抗：AM093、鼠抗人Cdc2单抗：C-9及SP免疫组化试剂盒均购自北京中杉金桥公司。4种抗体工作浓度均为1 ∶100。

1.3 随访 全部病例进行门诊或电话随访，随访时间为6个月～9年6个月，随访截止至2015年12月31日，随访率为100%。

1.4 方法

1.4.1 PCR-DNA反向点杂交 应用HPV核酸检测试剂盒进行点杂交。取石蜡包埋涎腺肿瘤组织标本，按试剂盒操作说明进行HPV-DNA提取、PCR扩增、杂交、洗膜和显色。结果判读：阳性质控品杂交膜条在相应的HPV基因型位点及IC位点出现显色信号(蓝色斑点)，其它位点不显色；阴性质控品杂交膜条除IC位点出现显色信号外，其它位点不显色。按照膜条上探针排列顺序，依据显色信号的有无判读结果，依据显色信号的位置判定HPV基因型。

1.4.2 免疫组化 标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，行HE及免疫组化染色，SP法检测p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白表达。用已知p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白表达阳性标本作阳性对照，以磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。p53蛋白定位于细胞核；EGFR蛋白主要定位于细胞膜和胞质，阳性细胞呈散在或片状分布。p16、Cdc2蛋白阳性部位在细胞核和(或)细胞质内，单独胞质不视为阳性。观察染色切片中10个具有代表性的高倍视野，染色为棕黄色视为阳性细胞。阳性细胞数≥10%定为阳性，<10%或无着色者定为阴性。

1.5 统计学方法 应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，HPV感染及p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白表达与临床病理指标采用χ2检验或Fisher确切概率法；生存分析采用Kaplan-Meier生存分析，多因素分析用Cox回归模型进行。所有数据均采用双侧检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 涎腺ACC组织中HPV感染及p53、p16、EGFR及Cdc2表达 PCR-DNA反向点杂交检测结果显示：涎腺ACC组织中HPV感染率为0(0/76)；免疫组化结果显示：ACC组织中p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白阳性率分别为76.3%(58/76)、57.9%(44/76)、60.5%(46/76)及64.5%(49/76)(图1)。χ2检验显示，p53、p16、EGFR及Cdc2表达与涎腺ACC患者性别、年龄、肿瘤部位、TNM分期及病理类型无明显相关性(表1)。

2.2 涎腺ACC组织中p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白表达与预后的关系 截止随访至2015年12月31日，有18例患者死亡，总病死率为23.7%(18/76)。全组患者中位总生存期(overall survival, OS)为63个月，5年存活率为57.9%(44/76)。Kaplan-Meier生存分析显示：p53表达与患者中位OS差异无统计学意义(χ2=0.009，P=0.924)；p16表达与患者中位OS差异无统计学意义(χ2=0.561，P=0.454)；EGFR阳性患者中位OS为61个月，低于阴性患者的75个月(图2)。Cdc2阳性患者中位OS为53个月，低于阴性患者的69个月(图3)。中位OS与患者性别、年龄、TNM分期、肿瘤部位、病理类型差异无统计学意义。全组患者中位无进展生存期(progression-free survival, PFS)为40个月，p53表达与患者中位PFS差异无统计学意义(χ2=0.561，P=0.454)；p16表达与患者中位PFS差异无统计学意义(χ2=0.400，P=0.527)；EGFR阳性患者中位PFS为36个月，低于阴性患者的46个月(图4)。Cdc2阳性患者中位PFS为36个月，低于阴性患者的50个月(图5)。中位PFS与患者性别、年龄、TNM分期、肿瘤部位、病理类型差异无统计学意义。多因素Cox回归模型分析显示：EGFR与Cdc2阳性是涎腺ACC患者预后的独立危险因素(RR=13.417、13.075，P均<0.001，表2)。p53、p16表达情况并未显示出与生存率有关。

表1 涎腺腺样囊性癌中p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白表达与临床病理特征的关系

ABCD

图1 A. 腺样囊性癌组织中EGFR阳性；B.腺样囊性癌组织中Cdc2阳性；C.腺样囊性癌组织中p53阳性；D.腺样囊性癌组织中p16阳性，SP法

图2 腺样囊腺癌组织中EGFR表达与患者总生存期的关系

图3 腺样囊腺癌组织中Cdc2表达与患者总生存期的关系

图4 腺样囊腺癌组织中EGFR表达与患者无进展生存期的关系

图5 腺样囊腺癌组织中Cdc2表达与患者无进展生存期的关系

3 讨论

ACC是起源于腺体导管的恶性肿瘤，组织学类型以筛状、管状、实性的生长方式为主，伴有多少不等的黏液及粉染基膜样物质，肿瘤细胞内衬导管上皮和肌上皮的分化特点，易出现神经侵犯及转移，预后不佳，探寻影响其预后因素的研究一直备受临床关注。2012年国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)调查数据显示，由HPV诱发的头颈癌发生率逐年增加，特别是口腔颌面部肿瘤[3]。目前HPV在涎腺恶性肿瘤发病及预后的研究尚少，研究结果也并不一致。Boland等[4]采用原位杂交法检测ACC标本时发现无1例HPV阳性病例。Justin等[5]亦发现鼻腔鼻窦外的ACC组织中HPV检测呈阴性。Hühns等[2]的研究结果显示17例ACC标本中有4例HPV16阳性，阳性率为25%。国内霍真等[6]采用原位杂交法检测27例肺ACC标本发现HPV均阴性。本组实验发现，在76例涎腺ACC组织中未检出HPV感染，提示发生在涎腺的ACC与HPV感染可能无关。

表2 涎腺腺样囊性癌患者的多因素Cox回归模型预后分析

在以往的临床经验中，p16蛋白在多种头颈部肿瘤组织中已作为HPV感染状态的替代指标，但在ACC组织中的评价作用一直备受争议。Isayeva等[7]报道p16在ACC中的阳性率为64%。Lassen等[8]在研究丹麦人咽及声门上癌的试验中发现，p16阳性率为22%并与HPV感染密切相关。p16阳性患者较阴性患者有较高的5年肿瘤局部控制率(58% ∶28%，P=0.000 5)、疾病特异性生存率(72% ∶34%，P=0.000 6)及总生存率(62% ∶26%，P=0.000 3)。Xing等[9]报道外阴和子宫颈的ACC组织中高危型HPV感染与p16蛋白表达之间并无关联。Boland等[4]亦证实以检测p16的方法来代替HPV检测在ACC组织中并不适用。本组实验发现p16在76例涎腺ACC组织中的阳性率为57.9%(44/76)，但无1例HPV感染，推测两者之间并无关联。因此在涎腺ACC组织中p16表达并不能作为HPV状态的替代指标。

由HPV诱发的肿瘤多与野生型p53肿瘤抑制基因有关。野生型p53蛋白在体内的半衰期短，免疫组化法无法检测到，而突变型p53蛋白的半衰期长，可通过免疫组化法检出。因此，在HPV导致的肿瘤组织中p53蛋白的表达多呈阴性。文献关于p53在ACC组织中的阳性率报道不一。Jiang等[10]研究发现p53在腮腺ACC组织中的阳性率为45.7%，但与患者生存期无关。Huo等[11]报道在肺ACC组织中p53阴性。本组实验发现，p53在涎腺ACC组织中的阳性率为76.3%，p53阳性患者生存期短于阴性患者，但差异无统计学意义，其对ACC患者预后评价的作用有待进一步扩大样本量进一步研究证实。

EGFR参与许多人类恶性肿瘤的发生、发展，在肿瘤生长和转移过程中起重要作用。不同类型的涎腺恶性肿瘤中EGFR基因拷贝数或蛋白阳性率并不一致。Wang等[12]研究发现，在ACC组织中EGFR表达明显增加，且在筛状及管状两种组织类型中的阳性率高于实体型。本组实验结果显示EGFR在涎腺ACC中的阳性率为60.5%，在Ⅰ期和Ⅱ期肿瘤组织中的阳性率低于Ⅲ期和Ⅳ期组织，但差异无统计学意义，尚需增加样本量进一步验证。经多因素Cox回归模型分析显示EGFR蛋白表达与生存期短有关，是影响涎腺ACC患者预后的独立因素。

Cdc2是调控细胞周期的重要激酶，其主要作用是在G2/M检验点检查DNA纺锤体中微管的组装及着丝点位置的正确连接，Cdc2表达异常可直接导致细胞分化障碍、诱导细胞异常转化进而促进肿瘤发生[13]。有文献报道Cdc2蛋白已在多种头颈部恶性肿瘤组织中出现过表达，如喉癌[14]、舌鳞癌[15]等。孙玉满等[16]研究发现Cdc2在喉癌组织中的阳性率为70.6%，明显高于癌旁阴性切缘组织，且Cdc2在切缘组织中阳性的患者术后复发率明显高于阴性患者。但其在涎腺组织中的表达情况尚无报道。本组实验显示，Cdc2蛋白在涎腺ACC组织中的阳性率高达64.5%(49/76)，单因素Cox回归模型分析显示Cdc2阳性患者较阴性患者的中位OS短24个月(P=0.001)，多因素Cox回归模型分析提示Cdc2阳性表达与ACC生存期短有关，是影响患者预后的独立因素。

综上，本组实验中涎腺ACC组织中未检测出HPV感染。p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白在多数ACC组织中均有表达，但p16不能作为涎腺ACC患者HPV感染状态的替代指标。EGFR及Cdc2阳性患者预后差于阴性患者，临床对上述两种蛋白阳性的患者应密切随访。

[1] Lee S K, Kwon M S, Lee Y S,etal. Prognostic value of expression of molecular markers in adenoid cystic cancer of the salivary glands compared with lymph node metastasis: a retrospective study[J]. World J Surg Oncol, 2012,10:266.

[2] Hühns M, Simm G, Erbersdobler A, Zimpfer A. HPV infection, but Not EBV or HHV-8 infection, is associated with salivary gland tumours[J]. BioMed Res Int, 2015,2015:829349.

[3] Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M,etal. Estimated cancer incidence, mortality and prevalence worldwide in 2012[M]. Lyon: IARC Press, 2012.

[4] Boland J M, McPhail E D, García J J,etal. Detection of human papilloma virus and p16 expression in high-grade adenoid cystic carcinoma of the head and neck[J]. Mod Pathol, 2012,25(4):529-536.

[5] Justin A B, Takenori O, Edward B S,etal. Human papillomavirus-related carcinoma with adenoid cystic-like features: a peculiar variant of head and neck cancer restricted to the sinonasal tract[J]. Am J Surg Pathol, 2013,37(6):836-844.

[6] 霍 真, 孟云霄, 凌 庆, 等. 肺腺样囊性癌中Myb与预后及p16与HPV感染的关系[J]. 诊断病理学杂志, 2016,23(2):81-84.

[7] Isayeva T, Said-Al-Naief N, Ren Z,etal. Salivary mucoepidermoid carcinoma: demonstration of transcriptionally active human papillomavirus 16/18[J]. Head Neck Pathol, 2013,7(2):135-148.

[8] Lassen P, Eriksen J G, Hamilton-Dutoit S,etal. Effect of HPV-associated p16INK4A expression on response to radiotherapy and survival in squamous cell carcinoma of the head and neck[J]. J Clin Oncol, 2009,27(12):1992-1998.

[9] Xing D, Schoolmeester J K, Ren Z,etal. Lower female genital tract tumors with adenoid cystic differentiation: p16 expression and high-risk HPV detection[J]. Am J Surg Pathol, 2016,40(4):529-536.

[10] Jiang L C, Huang S Y, Zhang D S,etal. Expression of beclin 1 in primary salivary adenoid cystic carcinoma and its relation to Bcl-2 and p53 and prognosis[J]. Braz J Med Biol Res, 2014,47(3):252-258.

[11] Huo Z, Meng Y X, Wu H W,etal. Adenoid cystic carcinoma of the tracheobronchial tree: clinicopathologic and immunohistochemical studies of 21 cases[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014,7(11):7527-7535.

[12] Wang W M, Zhao Z L, Zhang W F,etal. Role of hypoxia-inducible factor-1α and CD146 in epidermal growth factor receptor-mediated angiogenesis in salivary gland adenoid cystic carcinoma[J]. Mole Med Rep, 2015,12(3):3432-3438.

[13] Yang J Q, Liu H X, Liang Z,etal. Over-expression of p53, p21 and Cdc2 in histologically negative surgical margins is correlated with local recurrence of laryngeal squamous cell carcinoma[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014,7(7):4295-4302.

[14] 刘宏侠, 孙玉满, 杨俊泉, 等. 喉癌与手术切缘组织PCNA和Cdc2表达与局部复发相关性研究[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2015,21(21):1701-1705.

[15] Wada S, Yue L, Furuta I. Prognostic significance of p34cdc2 expression in tongue squamous cell carcinoma[J]. Oral Oncol, 2004,40(2):164-169.

[16] 孙玉满, 刘宏侠, 杨俊泉, 等. 细胞周期依赖性蛋白激酶1(Cdk1/p34cdc2)对喉癌术后局部复发的预测价值[J]. 临床与实验病理学杂志, 2015,31(3):293-297.

Correlation of HPV infection and expression of p53, p16, EGFR and Cdc2 with prognosis in salivary adenoid cystic carcinoma

SUN Yu-man1, WU Meng2, HAN Feng-yan1, LIU Hong-xia1, YANG Jun-quan3, WANG Hong-bin3
(1DepartmentofPathology,TangshanXieheHospital,Tangshan063004,China;2DepartmentofBasicMedicine,PathologicalTeachingandResearchingSection,TangshanVocationalandTechnicalCollege,Tangshan063004,China;3DepartmentofRadio-chemotherapyOncology,TangshanPeople’sHospital,Tangshan063001,China)

Purpose To investigate the relationship between HPV infection and p53, p16, EGFR expression and prognosis in patients with salivary adenoid cystic carcinoma (ACC). Methods Totally 76 cases of adenoid cystic carcinoma specimens were selected, PCR-reverse dot blot hybridization was used to detect infection of HPV and SP immunohistochemical method was adopted to detect the expression of p53, p16, EGFR, Cdc2 in tumor tissues. Clinical data were collected and all the patients were followed up. The Kaplan-Meier method was used to estimate median overall survival and the Log-rank test to compare survival curves. Cox regression model was used for multivariate analyses. Results Infection rate of HPV in adenoid cystic carcinoma tissues was 0(0/76). The expression rate of p53, p16, EGFR, Cdc2 protein in adenoid cystic carcinoma tissues were 76.3%(58/76), 57.9%(44/76), 60.5% (46/76)and 64.5% (49/76)respectively. There was no correlation of the expression of p53, p16, EGFR and Cdc2 with gender, age, tumor location, TNM stage and histological type of patient. Kaplan-Meier survival analysis showed that EGFR-positive patients had shorter median overall survival rate (OS) than the negative ones (χ2=19.111,P<0.001). EGFR-positive patients had shorter median progression-free survival rate(PFS)than the negative ones (χ2=6.621,P<0.01). Cdc2 positive patients had shorter median OS than the negative ones (χ2=3.870,P<0.05). Cdc2 positive patients had shorter median PFS than the negative ones (χ2=6.755,P<0.01). Cox regression analysis showed that expression of EGFR and Cdc2 was independent risk factors for the prognosis of patients with salivary gland ACC (relative risk=13.417, 13.075,P<0.001). Conclusion There is no HPV infection detected in adenoid cystic carcinoma tissues. p53, p16, EGFR and Cdc2 are positively expressed in most salivary adenoid cystic carcinoma. p16 is unsuitable as a surrogate for HPV infection status of patient with ACC. Expression of EGFR and Cdc2 is independent risk factors in the prognosis of patients with salivary gland ACC. For the EGFR or Cdc2 positive patients should be followed up closely.

salivary neoplasms; adenoid cystic carcinoma; HPV; EGFR; Cdc2; prognosis

1河北省唐山市协和医院病理科，唐山 0630042唐山职业技术学院基础医学部病理学教研室，唐山 063004

3河北省唐山市人民医院放化疗科，唐山 063001

孙玉满，男，副主任医师。E-mail: symts@163.com 刘宏侠，女，硕士，主任医师，硕士生导师，通讯作者。 E-mail: lhx1lmq@126.com

时间：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.009.html

R 739.87

A

1001-7399(2017)04-0393-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.009

接受日期：2017-02-10