NET-1活化NF-κB信号途径促进子宫颈鳞癌微血管生成

2017-06-05张雨婷张文辉熊秀娟况晓东宋恩霖

临床与实验病理学杂志 2017年3期

张雨婷，张文辉，熊秀娟，况晓东，宋恩霖

张雨婷1，张文辉2，熊秀娟1，况晓东1，宋恩霖1

目的探讨NET-1表达与子宫颈癌微血管生成的关系及其分子机制。方法采用免疫组化MaxVision法检测80例子宫颈鳞癌、10例慢性子宫颈炎组织中NET-1、NF-κB p65、VEGF蛋白表达。采用CD34内皮标记，结合Weinner计数法检测子宫颈鳞癌组织的微血管密度(microvascular density, MVD)。通过阳离子脂质体将真核表达质粒pCMV6-NET-1转染子宫颈鳞癌细胞以获得NET-1基因过表达；利用NF-κB特异抑制剂PDTC处理子宫颈鳞癌细胞以抑制NF-κB的激活；应用Western blot法检测细胞蛋白的表达。结果子宫颈鳞癌组织中NET-1呈高表达，NET-1表达与子宫颈鳞癌MVD、NF-κB p65和VEGF蛋白表达呈正相关。NET-1基因转染引起子宫颈鳞癌SiHa细胞胞核NF-κB p65和胞质VEGF水平上高，应用NF-κB抑制剂PDTC预处理SiHa细胞能显著抑制NET-1引起的VEGF表达上调。结论 NET-1促进子宫颈鳞癌微血管生成，其机制与NET-1激活子宫颈鳞癌NF-κB信号途径上调VEGF表达有关。

子宫颈肿瘤；鳞癌；NET-1；NF-κB；VEGF；微血管生成

实体肿瘤血管形成与肿瘤细胞的生长、侵袭以及转移密切相关。实验证实，微血管增生在子宫颈癌侵袭转移过程中起重要作用，与子宫颈癌不良预后显著相关[1]。故研究肿瘤血管生成相关调节因子及其作用机制，对肿瘤生物的治疗具有重要意义。NET-1是小G蛋白RhoA特异的鸟苷酸交换因子，通过激活RhoA信号调节细胞增殖、分化、细胞周期和细胞骨架重排，具有类似原癌基因的功能。目前已发现，NET-1的表达与子宫颈癌、肺癌、肝癌和胶质细胞瘤等多种肿瘤发生、发展有关，但NET-1与子宫颈癌微血管生成的关系尚未见报道。Vessichelli等[2]报道，NET-1与CARMA蛋白相互作用激活NF-κB信号途径。NF-κB信号途径参与缺氧情况下HIF-1的转录活化，最终上调与血管生成相关的下游靶基因如VEGF等的表达，从而促进肿瘤的微血管生成。本文通过检测子宫颈鳞癌组织中NET-1、NF-κB p65、VEGF蛋白的表达，结合CD34内皮标记检测肿瘤微血管密度(microvascular density, MVD)，并在细胞学水平观察NET-1对子宫颈癌细胞NF-κB的激活作用及其对下游VEGF表达的影响，分析NET-1与子宫颈癌微血管生成的关系及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集中山大学附属第一医院确诊的浸润性子宫颈鳞癌石蜡包埋标本80例，患者平均年龄44岁，其中低分化27例，中+高分化53例。按FIGO(2014)分期标准：Ⅰ期48例，Ⅱ期32例。肿瘤直径≥4 cm者22例，淋巴结转移者38例，脉管浸润阳性者28例。所有患者术前均未行放、化疗，另取10例慢性子宫颈炎标本作为对照组。

1.2 免疫组化免疫组化采用MaxVision法染色，3～5 μm厚石蜡切片常规脱蜡，柠檬酸抗原热修复，3%H2O2处理，PBS漂洗。一抗兔抗人多克隆NET-1抗体，购自ProteinTech公司；兔抗人NF-κB p65 抗体，购自Abnova公司；兔抗人VEGF抗体，购自Abgent公司；工作液50 μL，4 ℃过夜，PBS洗涤后50 μL MaxVision二抗工作液(KIT-5010，福州迈新公司)，室温下孵育30 min，洗涤后DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固。以PBS代替一抗作阴性对照。

测量平均光密度(mean optic density, MOD)进行蛋白表达半定量结果判定。在光镜下(×400)选取肿瘤组织中阳性最强的5个高倍视野，数码拍照，图像分析软件Image-Pro Plus 6.0准确分割阳性区域，测量MOD值。相同条件下，每张图片测量3次，以3次测量的均值作为该视野中蛋白的表达强度。最后再以同一切片5个不同视野的MOD均数，作为该切片所代表的样本组织中蛋白的平均表达强度。

1.3 MVD检测采用Weidner法检测子宫颈癌组织中MVD。CD34免疫组化染色后(鼠抗人CD34单克隆抗体，福州迈新公司)以黄色颗粒状标记的血管内皮为标准，切片在光镜下(×100)挑选MVD分布最高区域，在光镜下(×200)计数5个不同视野中被CD34染成阳性的微血管数量，取其平均值作为MVD值。每个与邻近微血管分离明显的阳性染色单个血管内皮细胞或血管内皮细胞簇均视为1个独立的微血管，结构不相连的分支血管结构也计作1个微血管。直径>8个红细胞的血管，带有厚的平滑肌血管或者硬化坏死区血管不在计数范围内。

1.4 子宫颈癌细胞NET-1基因瞬时转染 SiHa细胞(TCHu113，中国科学院细胞库)用含10%胎牛血清、10%青霉素-链霉素的DMEM培养基常规培养于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中。2×105/mL接种于24孔板，待生长达90%～95%融合度时，更换培养基为无血清培养基。分别用无血清培养基50 μL稀释0.8 μg的pCMV6-NET-1表达质粒(SC321265，OriGene公司)和2 μL脂质体Lipofectamin 2000(Invitrogen公司)，室温静止5 min，两者混合制备转染复合物，室温静止25 min，加入对应孔板中。利用空质粒载体转染作为阴性对照，利用未转染组为空白对照。转染后培养6 h，更换培养基为不含双抗含10%血清的DMEM高糖培养基。继续培养至48 h，通过Western blot法检测转染效果。

1.5 Western blot法利用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，用以检测NET-1和VEGF蛋白表达；利用细胞核蛋白提取试剂盒(Cwbiotech公司)提取细胞核蛋白，用于检测细胞核NF-κB p65蛋白表达。蛋白浓度测定后，按每孔20 μL上样量用Loading Buffer配平，沸水加热后上样，行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，转至硝酸纤维膜。经洗涤后，加入一抗(工作浓度1 ∶1 000，内参β-actin为1 ∶5 000，β-actin鼠单克隆抗体，购自ProteinTech公司)，37 ℃孵育1 h后4 ℃过夜；PBST洗涤后加入二抗(工作浓度1 ∶5 000)。洗涤膜后，利用Easy See化学发光试剂盒孵育发光，显影。利用Image Tool测量目的蛋白条带和内存条带的灰度值，以目的条带灰度值与内存灰度值的比值作为蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1 子宫颈鳞癌组织中NET-1表达及其与NF-κB p65和VEGF表达的关系肿瘤组织HE染色显示，瘤细胞呈巢、团状分布，与纤维性间质分界清楚，部分瘤组织中可见角化现象，为浸润性子宫颈鳞癌。子宫颈炎组织中，NET-1弱表达于鳞状上皮颗粒细胞层和棘细胞层细胞胞核，且呈散在分布。NET-1表达于癌巢中肿瘤细胞胞质和胞核，呈棕褐色颗粒，癌巢周围纤维性间质偶见少量表达(图1)。NF-κB p65主要表达于肿瘤细胞胞核，呈棕黄色颗粒，部分瘤细胞呈胞质和胞核阳性(图2)。VEGF表达于肿瘤细胞胞质，呈棕黄色颗粒，癌巢周血管组织和少量纤维间质可见表达(图3)。光密度检测分析发现，子宫颈鳞癌组织中NET-1的平均表达强度显著高于慢性子宫颈炎组织(表1)。相关性分析结果显示，NET-1表达分别与NF-κB和VEGF表达呈正相关(rs=0.272，P=0.015；rs=0.325，P=0.003)。

表1 慢性子宫颈炎和子宫颈鳞癌组织中NET-1的表达(±s)

2.2 子宫颈鳞癌组织中NET-1的表达与MVD的关系 CD34内皮标记显示，子宫颈鳞癌微血管分布于癌巢之间和癌巢内瘤细胞之间(图4)，平均MVD为21.1。t检验结果显示，NET-1表达水平较高组(以NET-1的总体平均表达强度0.182±0.036为分组临界值)的子宫颈鳞癌组织中MVD显著高于NET-1表达水平较低组(t=-2.113，P=0.038)。进一步相关性分析显示，NET-1的表达与子宫颈鳞癌MVD呈正相关(rs=0.291，P=0.009)。

2.3 NET-1通过活化NF-κB信号途径上调VEGF表达 NET-1基因转染组、阴性转染组和空白未转染组SiHa细胞NET-1蛋白表达强度分别为0.986±0.021、0.523±0.015和0.508±0.018(图5)。转染组细胞NET-1的表达显著高于阴性转染组(t=1.08，P<0.001)和空白未转染组(t=29.45，P<0.001)，而阴性转染组和空白未转染组之间差异无显著性，提示NET-1基因转染显著提高SiHa细胞NET-1蛋白的表达水平。与此同时，在阳性转染组胞核NF-κB p65和细胞VEGF的表达水平(1.27±0.085、0.87±0.032)均分别显著高于阴性转染组(0.55±0.010，t=14.50，P<0.001；0.37±0.011，t=25.89，P<0.001)和空白未转染组(0.52±0.035，t=13.99，P<0.001；0.035±0.029，t=21.1，P<0.001)。利用NF-κB激活的特异抑制剂PDTC(本实验室储存)预处理SiHa细胞，再对该组细胞和另一组未处理的正常SiHa细胞同时进行NET-1基因瞬时转染，应用Western blot法检测发现，在预处理组细胞NF-κB信号激活受抑制的情况下，该组VEGF的表达水平(0.39±0.036)显著低于未处理组(0.86 ± 0.032，t=16.9，P<0.001，图6)。

①②③④

图1 子宫颈鳞癌组织中NET-1的表达，呈胞质和胞核阳性，MaxVision法图2 子宫颈鳞癌组织中NF-κB p65的表达，呈胞核阳性，部分呈胞核和胞质阳性，MaxVision 法图3 子宫颈鳞癌组织中VEGF的表达，呈胞质阳性，MaxVision 法图4 子宫颈鳞癌组织中CD34内皮标记的微血管，MaxVision法

图5 NET-1基因瞬时转染组、阴性转染组和空白未转染组SiHa细胞中NET-1、胞核NF-κB p65和细胞VEGF的表达

图6 PDTC对NET-1基因转染后SiHa细胞中胞核NF-κB p65和细胞VEGF表达水平的影响

3 讨论

NET-1最初通过基因克隆技术在神经上皮瘤细胞中发现，后经研究证实其为小G蛋白家族RhoA特异的鸟苷酸交换因子，能激活RhoA信号途径，因而认为NET-1能参与调节细胞的增殖、凋亡、分化和骨架重排等一系列重要生物学过程。相继有较多文献发现，NET-1与多种肿瘤发生、发展有关，如NET-1的表达能促进胃癌[3]、皮肤癌[4]、乳腺癌[5]、食管癌[6]和肝癌[7]的增殖和浸润能力，且NET-1的高表达与非小细胞肺癌[8]预后不良有关。NET-1促进肿瘤进展的分子机制主要与其激活RhoA有关，如NET-1通过激活RhoA调节胃癌细胞骨架重排从而促进胃癌细胞的迁移浸润能力[3]，而NET-1活化的RhoA对于TGFβ介导的乳癌细胞上皮-间质转化是必须的[9]。NET-1分子结构上隶属于含4个跨膜区域蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily, TM4SF)，其功能是作为分子的服务性蛋白，通过结合特异的细胞表面蛋白，增强功能性信号复合物的形成和稳定，从而参与细胞的活化与增殖、黏附与迁移等。Carr等[10]研究证实，NET-1与FAK相互作用并激活FAK参与调节乳腺癌细胞的运动迁移能力。最近文献报道[2]，NET-1能与CARMA家族蛋白结合，从而介导NF-κB信号通路的激活。Panahi等[11]实验表明，NF-κB信号途径的激活是实体肿瘤微血管生成重要机制之一，故NET-1可能通过激活NF-κB信号途径促进肿瘤微血管生成。然而，目前关于NET-1与肿瘤血管生成的关系报道较少。评价肿瘤血管形成程度的最客观标准是MVD，而CD34是目前较敏感的血管标志物，对肿瘤组织内微小血管及新生的不完整血管较为敏感[12]。本课题通过CD34标记微血管内皮检测子宫颈癌MVD，免疫组化检测子宫颈癌组织中NET-1、NF-κB p65和VEGF的表达，并进一步结合细胞水平实验，分析NET-1与子宫颈癌细胞血管诱生能力的关系。

本实验结果显示，与慢性子宫颈炎组织相比，NET-1在子宫颈鳞癌组织中高表达，提示NET-1可能参与子宫颈鳞癌的发生、发展。相关性分析结果显示，NET-1的表达与子宫颈癌MVD、NF-κB p65和VEGF分别呈正相关，提示NET-1促进子宫颈癌微血管增生可能与激活NF-κB信号途径进而上调子宫颈癌VEGF表达有关。NF-κB受上游信号因子激活后，p65亚单位易位至细胞核，通过其DNA结合位点发挥转录调控作用。本实验利用NET-1表达质粒瞬时转染子宫颈鳞癌SiHa细胞，并检测胞核p65和胞质VEGF的表达，分析NET-1的表达对NF-κB信号的活化及其对VEGF表达的影响。实验结果显示，阳性转染组细胞中NET-1表达水平显著高于阴性转染组和空白未转染组，说明基因转染成功；且细胞中NF-κB p65和VEGF的表达水平也分别显著提高，提示NET-1激活子宫颈癌细胞NF-κB信号且上调VEGF的表达。为进一步阐明NF-κB的激活与VEGF上调的关系，本实验利用NF-κB特异的激活抑制剂PDTC预处理SiHa细胞，观察在NF-κB信号受抑的情况NET-1对VEGF表达的影响。实验结果显示，在NET-1转染的SiHa细胞中，PDTC显著抑制NF-κB p65的细胞核水平，同时VEGF的表达水平也显著下降，提示NET-1能通过活化NF-κB信号上调子宫颈癌VEGF的表达。Hölters等[13]证实NET-1能促进子宫颈癌SiHa细胞体外浸润能力，且排除NET-1对子宫颈癌FAK和PI3K信号的激活作用，但并未分析NET-1对NF-κB的激活作用。NET-1促进子宫颈癌细胞浸润能力是否也与NF-κB的活化有关，尚待进一步实验分析。

综上所述，本组实验结果认为NET-1表达能促进子宫颈癌微血管生成，且其分子机制与NET-1活化NF-κB信号途径，进而上调VEGF表达以增强子宫颈癌血管诱生能力有关。

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NET-1 promote the angiogenesis of cervical squamous cell carcinoma by activating NF-kappa B signaling pathway

ZHANG Yu-ting1, ZHANG Wen-hui2, XIONG Xiu-juan1, KUANG Xiao-dong1, SONG En-lin1

(1DepartmentofPathology,MedicalCollegeofNanchangUniversity,Nanchang330006,China;2DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)

Purpose To explore the association of NET-1 expression with the angiogenesis of cervical squamous cell carcinoma and the related molecular mechanism. Methods Immunohistochemistry MaxVision was used to detect the expression of NET-1, NF-κB p65 and VEGF in 80 cases of cervical squamous cancer tissue and 10 cases of chronic cervicitis tissue. The microvascular density (MVD) was assessed by labeling endothelia with CD34- antibody and counted according to Weinner’s standard. The eukaryotic expression plasmid pCMV6-NET-1 was transfected into cervical squamous cancer cells by cationic liposome in order to obtain over expression of NET-1 gene.In order to inhibit the activation of NF-kappa B, cervical squamous carcinoma cells were treated with NF-kappa B specific inhibitor PDTC. The protein expression in SiHa cells was assessed by Western blotting. Results The expression level of NET-1 in the cervical squamous carcinoma tissue was significantly higher than that in the tissue of control group. NET-1 expression was positively correlated to the MVD, NF-κB p65 and VEGF expression, respectively. Transient transfection of NET-1 gene significantly increased the nuclear expression of NF-κB p65 and cytoplasm expression of VEGF in the SiHa cells. However, pretreatment of SiHa cells with NF- inhibitor PDTC significantly inhibited NET-1 induced upregulation of VEGF expression. Conclusion NET-1 promotes the angiogenesis of cervical squamous carcinoma through the activation of the NF-κB signaling which upregulate the expression of VEGF in the cancer cells.

cervical neoplasm； squamous carcinoma； NET-1； NF-κB； VEGF； angiogenesis

时间：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.008.html

江西省教育厅科技项目(GJJ14087)、江西省科技厅科技支撑计划(2014BBG70066)

1南昌大学医学院病理学教研室，南昌 3300062中山大学附属第一医院病理科，广州 510080

张雨婷，女，硕士研究生。E-mail: 1977363165@qq.com 宋恩霖，男，博士，副教授，通讯作者。E-mail: songenling@126.com

R 737.33

1001-7399(2017)03-0268-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.008

接受日期：2017-01-07