细胞免疫化学p16/Ki-67双染预测子宫颈上皮内高级别瘤变

印永祥，赵 华，梁 洁，张金秋，赵 敏，王家俊

细胞免疫化学p16/Ki-67双染预测子宫颈上皮内高级别瘤变

印永祥1，赵 华1，梁 洁1，张金秋1，赵 敏2，王家俊2

目的 探讨细胞免疫化学p16/Ki-67双染预测子宫颈上皮内高级别瘤变及其意义。方法 随机收集行细胞学检查标本123例，其中不明意义的非典型鳞状上皮细胞(atypical squamous cell of undetermined significance, ASC-US)及以上病例(合计103例)同时行高危人乳头瘤病毒(high risk-human papillomavirus, HR-HPV)检测且具有活检结果，20例液基细胞学检查未见恶性细胞和上皮内病变细胞(negative for intraepithelial lesion or malignancy, NILM)，通过细胞免疫化学双染检测p16/Ki-67结果。结果 20例液基细胞学NLIM的标本中p16/Ki-67双染结果均阴性，ASC-US病例中预测CIN2+的敏感性66.67%、特异性95.92%、阳性预测值50.00%、阴性预测值97.92%，低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesions, LSIL)病例中预测CIN2+的敏感性91.67%、特异性95.00%、阳性预测值91.67%、阴性预测值95.00%，高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesions, HSIL)病例中预测CIN2+的敏感性92.86%、特异性0、阳性预测值92.86%、阴性预测值0；ASC-US及以上病例预测CIN2+的敏感性89.66%、特异性94.28%、阳性预测值86.67%、阴性预测值95.65%。结论 HR-HPV阳性的ASC-US和LSIL病例中进行p16/Ki-67双染检测，可以明显提高CIN2+检出的预测值，细胞免疫化学p16/Ki-67双染有望成为HPV筛查的有效辅助方法。

子宫颈上皮内瘤变；p16/Ki-67双染；细胞免疫化学；高危型人乳头瘤病毒

子宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，其病死率高。高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus, HR-HPV)感染是子宫颈癌及其癌前病变的主要致病因子。子宫颈细胞学检查能有效减少子宫颈癌的发生率和病死率，但细胞学只具有适度的敏感性，需要其他检测提高子宫颈癌筛查的有效性。国内外大量研究显示：肿瘤的发生、发展及预后与肿瘤抑制--------------------

基因p16及增殖细胞核抗原Ki-67活性密切相关[1-2]。组织学联合检测p16和Ki-67可作为子宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasis, CIN)分级诊断的辅助方法[3]，但有关子宫颈细胞学p16/Ki-67双染的报道较少。本文现结合细胞免疫化学p16/Ki-67双染、HR-HPV检测结果和病理活检结果，探讨细胞免疫化学p16/Ki-67双染在预测子宫颈上皮内高级别瘤变筛查中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2015年无锡市妇幼保健院病理科行细胞学检查的123例子宫颈病变，其中不明意义的非典型鳞状上皮细胞(atypical squamous cell of undetermined significance, ASC-US)及以上病例(合计103例)同时行HR-HPV检测且具有活检结果，患者年龄28～61岁，中位年龄39.5岁。20例细胞学检查未见恶性细胞和上皮内病变细胞(negative for intraepithelial lesion or malignancy, NILM)，患者年龄26～58岁，中位年龄38岁。

1.2 方法

1.2.1 细胞学检测 液基细胞学标本采用新柏氏TCT制片，改良巴氏染色。报告采用TBS分级系统：NILM、ASC-US、倾向高度病变的不典型鳞状上皮细胞、低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesions, LSIL)、高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesions, HSIL)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)。腺细胞病变不在本实验研究范围内，倾向高度病变的不典型鳞状上皮细胞归类于HSIL，ASC-US及以上病变认为液基细胞学(liquid-based cytology test, LCT)阳性。

1.2.2 HR-HPV DNA检测 采用杂交捕获Ⅱ代试验的检测方法，检测值<1.0 pg/mL为阴性，≥1.0 pg/mL为阳性。ASC-US及以上病例均为HR-HPV阳性。

1.2.3 病理活检 按WHO(2012)乳腺与女性生殖系统肿瘤病理与遗传学标准分级，其中子宫颈炎46例，病毒感染18例，子宫颈上皮内低级别瘤变(CIN1级)19例，子宫颈上皮内高级别瘤变(CIN2级和CIN3级)18例，SCC 1例。以CIN2级及以上病变称为CIN2+，认为其组织学阳性。

1.2.4 细胞学p16/Ki-67双染法 细胞薄片置于95%乙醇中固定30 min，流水冲洗1 min。双染试剂盒购自福州迈新公司。对标本进行EDTA 8.0热修复95 ℃ 20 min。滴加过氧化物酶100 μL，室温孵育10 min。滴加组合p16抗体、Ki-67抗体的一抗100 μL，室温孵育60 min。滴加酶标二抗100 μL，室温孵育15 min。滴加显色剂AP-RED 100 μL，室温孵育20 min。滴加显色剂DAB 100 μL，室温孵育5 min。苏木精衬染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.3 细胞学p16/Ki-67双染结果判断 阳性结果为染色片中观察1个或1个以上的细胞质呈红色，且细胞核呈棕黄色或红褐色。阴性检测结果为无子宫颈细胞同时出现细胞质呈红色，且细胞核呈棕黄色或红褐色，即存在仅对一种而非两种标志物有免疫反应性的子宫颈上皮细胞(如仅存在p16的棕色染色或仅存在Ki-67的红色染色)，或未见对两种标志物有免疫反应性的子宫颈上皮细胞，认为其检测结果阴性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞学预测CIN2+ 病例 因细胞学正常未做子宫颈活检，认为是子宫颈正常。与HSIL中病变检出率相比，CIN2+在ASC-US和LSIL病例中检出率明显减少(P<0.05，表1)。

表1 细胞学与组织学结果对比

与ASC-US、LSIL组相比，*P<0.05

2.2 细胞学正常标本中p16/Ki-67双染检测 20例细胞学正常的标本中p16/Ki-67双染结果全部阴性。

2.3 细胞学ASC-US标本中p16/Ki-67双染检测 54例ASC-US病例中有2例细胞学重新制片检测时细胞学中无典型特征细胞故剔除；52例ASC-US病例中有4例p16/Ki-67双染阳性，4例p16和Ki-67双染阳性中活检结果CIN2+者2例；敏感性66.67%、特异性95.92%、阳性预测值50.00%、阴性预测值97.92%。与TCT、HR-HPV双阳性相比，ASC-US组LCT、HR-HPV和p16/Ki-67双染三阳性时，阳性预测值明显提高(P<0.05，表2)。

2.4 细胞学LSIL标本中p16/Ki-67双染检测 34例LSIL病例中有2例细胞学重新制片检测时细胞学中无典型病变细胞故剔除；32例LSIL病例中有12例p16/Ki-67双染阳性，12例p16/Ki-67双染阳性中活检结果CIN2+者11例；敏感性91.67%、特异性95.00%、阳性预测值91.67%、阴性预测值95.00%。与LCT、HR-HPV双阳性相比，LSIL组LCT、HR-HPV和p16/Ki-67双染三阳性时阳性预测值明显提高(P<0.05，表2)。

2.5 细胞学LSIL标本中p16/Ki-67双染检测 15例HSIL中p16/Ki-67双染阳性14例，子宫颈活检结果CIN2+者13例；敏感性92.86%、特异性0、阳性预测值92.86%、阴性预测值0。HSIL组LCT、HR-HPV和p16/Ki-67双染三阳性时阳性预测值高于LCT、HR-HPV双阳性，但差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

2.6 细胞学ASC-US及以上标本中p16/Ki-67双染检测 ASC-US及以上标本99例中有30例p16/Ki-67双染阳性，30例p16/Ki-67双染阳性中活检结果CIN2+者26例，CIN1者2例，病毒感染2例。细胞免疫化学p16/Ki-67双染阳性的组织学标本，CIN2+的检出率(86.67%)明显高于CIN1的检出率(6.67%)。p16/Ki-67双染预测CIN2+的敏感性89.66%、特异性94.28%、阳性预测值86.67%、阴性预测值95.65%(表2，图1～4)。

①②③④

图1 p16/Ki-67在LCT中表达，p16/Ki-67均呈阴性，MaxVision法

图2 p16/Ki-67在LCT中表达，Ki-67呈单阳性，MaxVision法

图3 p16/Ki-67在LCT中表达，p16单阳性，MaxVision法

图4 p16/Ki-67在LCT中表达，p16/Ki-67双阳性，MaxVision法

3 讨论

子宫颈细胞学检查或子宫颈细胞学检查联合HR-HPV检测是目前主流的子宫颈癌初筛方法。很多发达国家沿用的常规细胞学或巴氏检查被证实能有效地降低子宫颈癌的发病率和病死率。超过99%的子宫颈癌与HR-HPV相关[4]。HPV检测有较高地阴性预测值，HPV阴性的妇女在5～7年内不会发展为子宫颈癌，因为有证据显示从最初感染HPV到子宫颈癌至少需要8年时间[5]。有研究认为HPV检测CIN2+优于细胞学[6]。

表2 p16/Ki-67双染结果与CIN2+比较

文献报道患者6个月后复查细胞学仅发现少数子宫颈上皮内高级别瘤变，其中28%的子宫颈上皮内高级别瘤变因HPV持续感染最终诊断，认为通过重复检查细胞学或HPV检测在减少阴道镜方面缺乏有效性[7]，需增加新的检测方法提高子宫颈高级别病变检出率。

细胞学诊断是形态学检测，医师需有丰富的临床经验，否则敏感性较低，假阴性及假阳性率介于5%～50%[8-9]，且因形态变化缺少客观的判断标准，造成诊断结果重复性不好[10-11]。最近研究证实p16和Ki-67的表达均与HR-HPV感染相关[12-13]。有文献报道测定子宫颈细胞内Ki-67和p16蛋白，用于检验HR-HPV感染引起子宫颈细胞异常增生[14-15]。以往研究大多是p16单染和(或)Ki-67单染进行评估，效果欠佳。有文献报道，p16过表达提示经HPV E7癌蛋白激活，但p16也表达在非异常的细胞上，p16只可能作为CIN1级的预后因子[16]。也有相反的文献报道，p16表达程度与CIN级别的升高有关[17]，使用p16染色用于裁定女性生殖道下段及肛门标本模棱两可的CIN2级诊断为低度病变或高度瘤变，可能会更准确预测病变级别，避免不必要的切除治疗[18]。本实验也发现，p16也部分表达于正常子宫内膜细胞、柱状细胞和化生细胞中。最近文献报道[19]在子宫颈细胞学标本检测p16/Ki-67双染蛋白表达，p16过表达诱导细胞周期阻滞，Ki-67作为通过HPV转化感染介导细胞周期调控的代替标志物。在一个细胞上p16/Ki-67双阳性可能作为通过HPV基因蛋白调控细胞周期的标志物，可能是HPV转化感染的标志物[20]。

HPV E6/E7检测比HPV DNA检测具有更高的特异性，在子宫颈癌筛查中具有重要的价值[21]，但是转化感染的重要标志物不必通过RNA或蛋白呈现，也可能经HPV感染后影响细胞的产物表达。本实验数据表明，p16/Ki-67联合检测在细胞学阳性标本中敏感性89.66%，特异性94.28%，阳性预测值86.67%。采用p16/Ki-67联合检测可能有重要的临床意义，p16/Ki-67双阳性与HR-HPV感染明显相关，与子宫颈高级别以上瘤变明显相关[20]。

有研究认为，细胞学ASC-US和LSIL中进行阴道镜检测具有较低的敏感性；尽管相比阴道镜检查而言，细胞学检测具有更少的合并症，但对ASC-US病例采取细胞学重复检测可能对一些有高级别瘤变及以上患者相比于阴道镜检查过低诊断，高敏感性的HPV检测有可能是对目前ASC-US病例中重复检测细胞学可替代的方法[22]。Gage等[23]报道，3年发生高级别瘤变及以上的风险从细胞学阴性、ASC-US和LSIL分别为0.30%、2.6%和5.2%，HPV联合ASC-US检测3年发生高级别瘤变及以上病例的风险中，HPV阴性为0.72%，HPV阳性为7.7%。ASC-US可能隐藏高级别瘤变或更严重的病变，本组结果显示有3.70%发生高级别瘤变，通过p16/Ki-67双染，在ASC-US病例中明显增加预测CIN2+阳性预测值至50.00%。Arbyn等[24]认为HPV检测因大多数LSIL中HR-HPV阳性率高而缺乏有效性。本实验通过p16/Ki-67双染，在LSIL中预测CIN2+阳性预测值明显增加至91.67%。作者认为p16/Ki-67双染在ASC-US和LSIL病例中进行检测有重要意义。但也有作者认为因缺少有效的证据，p16/Ki-67双染不能在ASC-US和LSIL分类中作为推荐的方法[25]。当然，本组发现HSIL中增加p16/Ki-67双染，子宫颈上皮内高级别瘤变的阳性预测值有所提高，但意义不大。

本实验还发现，细胞学阴性的标本无p16/Ki-67双阳性细胞，与细胞学阴性的标本无p16/Ki-67双阳性细胞[20]相符，但与Petry等[19]报道在HPV阳性而细胞学形态学正常的标本中p16/Ki-67双染阳性率为25.4%相反，有可能与细胞学医师诊断时的误差有关。

如果细胞学标本制备方法满足要求，单克隆抗体组合选择正确，细胞免疫化学可用来提高细胞学诊断的预见性。通过p16/Ki-67双染，阳性记数独立于细胞形态学，细胞学形态往往比较主观，当遇到模糊的异常病例又难以区别时可资鉴别。尽管目前在重复细胞学制片中存在少数病例中无阳性特征细胞，本实验认为有可重复性的细胞学制片的基础上，在HR-HPV阳性的细胞学标本上进行p16/Ki-67双染，可以减少一过性感染造成的假阳性；在HR-HPV阳性的细胞学标本上ASC-US和LSIL病例中进行p16/Ki-67双染，可以明显提高子宫颈上皮内高级别瘤变检出的预测值，减少阴道镜和子宫颈活检创伤性检查、不必要的患者心理压力和经济负担。细胞免疫化学p16/Ki-67双染可明显提高子宫颈上皮内高级别瘤变的检出率，有望实现以HPV筛查的有效辅助方法，可能成为子宫颈细胞学精准筛查的工具之一。

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Study of predictive value for detection of high-grade cervical intraepithelial neoplasia by p16/Ki-67 dual-stained liquid-based cytology

YIN Yong-xiang1, ZHAO Hua1, LIANG Jie1, ZHANG Jin-qiu1, ZHAO Min2, WANG Jia-jun2

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofGynecology,theAffiliatedMaternityandChildHealthHospitalofNanjingMedicalUniversity,Wuxi214002,China)

Purpose To study of predictive value for detection of high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN2+) by p16/Ki-67 dual-stained liquid-based cytology. Methods Random collection of 123 women including 103 samples of atypical squamous cell of undetermined significance (ASC-US) and above with results of high-risk human papillomavirus (HR-HPV) testing and cervical biopsy, 20 samples of negative for intraepithelial lesion or malignancy (NILM) by using immunocytochemical p16/Ki-67 dual-stained and the morphology assessment. Results In normal control group, the expression of p16/Ki-67 dual-stained in squamous epithelial cells were negative. Sensitivity of p16/Ki-67 dual-staind cytology for biopsy-confirmed CIN2+ was 66.67% (ASC-US), 91.67% (LSIL) and 92.86% (HSIL), specificity rates were 95.92% (ASC-US), 95.00% (LSIL) and 0 (HSIL), positive predictive value were 50.00% (ASC-US), 91.67% (LSIL) and 92.86% (HSIL), negative predictive value were 97.92% (ASC-US), 95.00% (LSIL) and 0 (HSIL), respectively. Conclusion p16/Ki-67 dual-stained cytology are improved obviously the predictive value for detection of CIN2+, p16/Ki-67 dual-stained cytology may efficiently complement HPV-based screening programs to prevent cervical cancer.

cervical intraepithelial neoplasia； p16/Ki-67 dual staining； immunocytochemistry； HR-HPV

时间：2

接受日期：2017-01-29

< class="content">基金项目：无锡市卫计委妇幼健康成果技术推广(FYTG2016-2)、无锡市卫生计生科技成果和适宜技术推广(T201645)

无锡市卫计委妇幼健康成果技术推广(FYTG2016-2)、无锡市卫生计生科技成果和适宜技术推广(T201645)< class="content">作者单位：南京医科大学附属无锡妇幼保健院1病理科、2妇科，无锡 214002

南京医科大学附属无锡妇幼保健院1病理科、2妇科，无锡 214002< class="content">作者简介：印永祥，男，硕士，副主任技师。E-mail： yinyrh@sina.com 赵 华，女，主任医师，通讯作者。E-mail： 18921116888@189.cn

印永祥，男，硕士，副主任技师。E-mail： yinyrh@sina.com 赵 华，女，主任医师，通讯作者。E-mail： 18921116888@189.cn017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.011.html

R 392.3； R 737.33

A

1001-7399(2017)03-0282-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.011