AEG-1与MMP-9在甲状腺乳头状癌中的表达及意义①

宋 瑒,王彩霞

(佳木斯大学附属第一医院病理科，黑龙江 佳木斯 154003)

AEG-1与MMP-9在甲状腺乳头状癌中的表达及意义①

宋 瑒,王彩霞

(佳木斯大学附属第一医院病理科，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：探讨星形胶质细胞升高基因1(Astrocyteelecatedgene-1,AEG-1)及基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinases-9,MMP-9)在甲状腺乳头状癌(papillarythyroidcarcinoma,PTC)中的表达及意义。方法：采用免疫组化EnVision法检测63例PTC及30例癌旁正常组织中AEG-1和MMP-9的表达，并复习相关文献。结果：AEG-1和MMP-9在PTC组中的阳性率分别为68.3%(43/63)、60.3%(38/63)，在癌旁正常对照组阳性率分别为23.6%(8/30)和16.7%(5/30)，AEG-1和MMP-9在PTC中阳性表达率均高于癌旁正常组织(χ2=14.192，P<0.05；χ2=15.577，P<0.05)。PTC中AEG-1和MMP-9表达具有一致性。AEG-1和MMP-9的表达与肿瘤大小、淋巴结转移密切相关，与患者性别、年龄无相关性，且AEG-1和MMP-9的表达呈正相关(r=0.142,P<0.05)。结论：AEG-1和MMP-9的表达与PTC发生、发展密切相关，联合检测二者可能对PTC的诊断及转移潜能提供新的理论依据。

AEG-1；MMP-9；甲状腺乳头状癌；免疫组织化学

甲状腺癌是甲状腺肿瘤最常见的类型，占甲状腺恶性肿瘤的70%～80%。女性比男性常见。可发生于任何年龄，最初诊断时的平均年龄大约为40岁。儿童的甲状腺恶性肿瘤90%为甲状腺乳头状癌。甲状腺乳头状癌在临床表现为甲状腺的肿块，甲状腺乳头状癌的发生受环境、遗传及激素因素的影响或这些因素的相互作用。部分患者有颈部放射线接触史。多数患者较早出现颈部淋巴结转移，部分转移还可至肺、骨、脑、肝等部位[1]。甲状腺癌的诊断贵在早期发现，早期治疗。经典型PTC与伴随乳头状增生的甲状腺结节在病理诊断中有时难以区别。本研究通过免疫组化EnVision两步法检测TPC及甲状腺组织中AEG-1、MMP-9的表达情况。探讨AEG-1、MMP-9与PTC发生、发展中的作用，为进一步揭示AEG-1、MMP-9在肿瘤中的作用提供实验基础。星形胶质细胞升高基因1(AEG-1)是近年多项研究表明AEG-1与肿瘤发生密切相关的基因，AEG-1是可促进肿瘤侵袭及转移的致癌基因，以及与化疗药物抵抗等特征有关[2,3]。基质金属蛋白酶9(MMP-9)具有很强的水解Ⅳ型胶原的能力，是肿瘤的侵袭和转移过程中最直接、最重要的金属蛋白酶之一。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究选取2010-06～2015-12佳木斯大学附属第一医院病理科保存的经手术切除的甲状腺乳头状癌的石蜡标本63例作为研究对象(63例均已证实为原发性甲状腺乳头状癌)随机选取同期切除的癌旁正常甲状腺组织30例。所有病例标本采用上述甲状腺乳头状癌的蜡块标本作3μm厚的连续切片，用免疫组化EnVision法染色后观察结果，统计患者性别、年龄(其中女28例、男35例，年龄15～78岁)、癌肿大小(肿瘤大体d≤2.0cm者30 例，d>2.0cm者33例)、及是否存在淋巴结转移；淋巴结转移39例(其中10例为微小乳头状癌淋巴结转移)，无淋巴结转移者24例。

1.2 试剂

兔抗人AEG-1多克隆抗体购自CellSignalingTechnology公司；鼠抗人MMP-9单克隆抗体工作液、即用型快捷免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术公司。

1.3 免疫组化检测

采用免疫组化EnVision法，分别对TPC和正常甲状腺组织用AEG-1和MMP-9抗体染色，统计表达情况。用胃癌组织做阳性对照，用PBS缓冲液替代一抗做阴性对照。

1.4 判读标准

镜下观察组织切片的染色强度，AEG-1和MMP-9阳性表达主要定位于细胞质，以出现胞质黄色、棕黄色或棕褐色为阳性表达。根据Beesley和Mclaren[4]分级方法，每张切片观察5个高倍视野(×400)，根据细胞染色强度和染色细胞所占的比例两者乘积作为判读标准。按阳性的细所占比例计数，阳性细胞占<5%为0分，阳性细胞占5%～25%为1分，阳性细胞占6%～50%为2分，阳性细胞占>50%记3分, 阳性细胞占>75%记4分；染色强度标判定计分，无色为0分，淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分，两种评分相乘，将结果分为：0～1分为阴性(-)，2～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性()，9～12分为强阳性()。

1.5 统计学方法

采用SPSS17.0 统计学系统软件处理，AEG-1和MMP-9临床病理因素采用χ2检验统计分析。AEG-1 与MMP-9相关性分析采用Spearman相关分析。

2 结果

2.1AEG-1在PTC及癌旁正常甲状腺组织中的表达

AEG-1在大部分PTC中表达，阳性表达为68.3%，在癌旁正常组织阳性率仅为26.7%，AEG-1在PTC的阳性表达明显高于正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。而AEG-1在PTC中的表达与肿瘤直径大小(P<0.05)、淋巴结转移(P<0.01)有关,但与患者性别、年龄无关(P>0.05)。

2.2MMP-9在PTC及癌旁正常甲状腺组织中的表达

MMP-9在PTC中阳性表达率为60.3%，在癌旁正常甲状腺组织阳性表达率仅为16.7%，MMP-9在PTC中阳性率明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。MMP-9在PTC中的表达与肿瘤直径大小(P<0.01)、淋巴结转移(P<0.01)有关，但与患者性别、年龄无关(P>0.05)。

2.3AEG-1与MMP-9表达与PTC参数相关关系

AEG-1高表达组中，MMP-9的阳性率为72.1%。该值显著高于MMP-9在阴性组中的表达(AEG-1阴性组中，MMP-9的阳性表达率为35.0%)，两者有统计学差异(χ2=7.847，P<0.05)。Spearman相关分析检测得出(r=0.142,P<0.05)。AEG-1与MMP-9在PTC中的表达呈正相关。见表1。

表1 AEG-1和MMP-9在PTC中表达的相互关系

3 讨论

肿瘤大小不一，从<1cm(微小癌)到几个厘米，并常见多中心生长。表现为不同的大体形态，大多数肿物切面为灰白色、实性、边界不清。镜下，肿瘤形成真正的乳头(有纤维血管轴心)，乳头通常复杂，具有分支，排列方向无序。毛玻璃样细胞核，核较大并有重叠。可见核沟及核内假包涵体。砂粒体的出现高度提示微乳头状癌的诊断。免疫组化染色：细胞角蛋白(CK)阳性，CK7+/CK20-，角蛋白19和高分子角蛋白染色阳性对诊断有一定的帮助，甲状腺球蛋白(Tg)和甲状腺转化因子-1(TTF-1)阳性，其他抗体包括galectin-3和HBME-1，虽然他们在乳头状癌中高比例表达，但并无特异性。多数患者较早发现淋巴结转移，还可转移至肺、骨、脑、肝等部位。PTC原发灶常较小，但发现是已转移至淋巴结，本实验分组中有25%为微小乳头状癌有淋巴结转移。而有无淋巴结转移成为预后的重要影响因素，因此了解PTC的转移和侵袭潜能有助于辅助诊断和评价甲状腺癌临床生物学行为。甲状腺癌的诊断贵在早期发现，早期治疗。

AEG-1是今年来新发现的对肿瘤发生发展来说是一个关键性的调控因子。今年研究表明AEG-1高表达与癌肿细胞，正常细胞则为阴性或低表达。AEG-1能够抑制肿瘤细胞侵袭和转移能力。Hu等[5]研究表明，食管鳞癌中AEG-1阳性表达明显强于对正常组织。Yu等[6]研究发现，乳腺癌发生肺转移AEG-1阳性表达率显著增高，而抑制AEG-1的表达则可降低乳腺癌肺转移率。另有研究表明，AEG-1强阳性能促使宫颈癌和神经胶质细胞转移[7]。用RNAi技术抑制AEG-1在神经胶质瘤、前列腺癌中的表达率，能抑制神经胶质瘤、前列腺癌转移[8]。但目前AEG-1在PTC中的表达研究较少。本研究表明，AEG-1在PTC中高表达而在良性甲状腺病变中仅少数呈散在弱阳性表达，其余为阴性。因此，AEG-1可为诊断PTC诊断工作提供依据，AEG-1低表达有助于良性肿瘤的判断和初步排除肿瘤存在恶性侵袭能力。

MMP-9基因位于染色体20q11.1～13.1，26～27kbp，具有13个外显子和9个内含子，属于基质金属蛋白酶(MMP)家族。主要功能是降解和重塑细胞外基质(extracellularmatris)的动态平衡。MMP-9包含一个V型的胶原蛋白结构域,这个结构域有高度的糖基化作用,它影响底物的特异性以及有抗衰变的作用[9]。MMP-9有许多作用底物，如Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型胶原、蛋白聚糖的核心蛋白、明胶、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白、弹性蛋白等，细胞因子及其受体也是MMP-9作用的底物。MMP能分解呼吸道和肺内的结构复合物如ECM和基底膜,因此能参与呼吸道和肺的重建[10]，它能降解α1抗胰蛋白酶，保护中性粒细胞弹性蛋白酶活性,能加强胶原质胶体中胶原细胞和MMP-13的溶胶原活动，它也抑制其他中性粒细胞的趋化因子。此外，MMP-9结合CD44可释放储存的TGF-β1，另外，MMP-9可通过释放血管内皮生长因子(VEGF)以参与血管生成。MMP-9分解Ⅳ型胶原分解基底膜，促进肿瘤向外和其它器官组织浸润及淋巴结转移。本例实验，MMP-9在PTC高表达与癌旁甲状腺组织，因此MMP-9与PTC的发生发展密切相关。PTC常发生于孤立的小结节，病灶常常较小，发现时往往已有淋巴结转移，本实验中25%微小乳头状癌有淋巴结转移。多数据报到认为淋巴结转移是影响预后的重要因素，因此了解PTC的转移和侵袭潜能有助于辅助诊断和评价甲状腺癌临床生物学行为。本研究发现，MMP-9高表达与患者年龄、性别无关，而肿瘤大小及淋巴结转移有关。提示MMP-9阳性率越高，形成Ⅳ型胶原酶能力越强，破坏基底膜能力越大，越容易发生肿瘤浸润和淋巴结转移。进一步表明检测MMP-9对肿瘤良恶性鉴别及评估PTC的生物学行为，提示MMP-9在甲状腺乳头状癌的发生及肿瘤转移中发挥重要作用。

综上所述，本实验结果提示，AEG-1与MMP-9协调参与了PTC的发生发展，联合检测，可能对PTC的病理诊断及转移潜能提供新的理论依据。但是AEG-1和MMP-9之间的相互调控机制，及抑癌基因的关系仍需更进一步增加实验临床研究。

[1]AHMADA.TheFrequencyofCervicalLymphNodeMetastasisinMultifocalPapillaryThyroid[J].FatimaJinnahMedicalCollegeJournal, 2014, 8(3):90-94

[2]LeeSG,SuZZ,EmdadL,etal.Astrocyteelevatedgene-1 (AEG-1)isatargetgeneofoncogenicHa-rasrequiringphosphatidylinositol3-kinaseandc-Myc[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences, 2006, 103(46):17390-17395

[3]EmdadL,SarkarD,SuZZ,etal.Recentinsightsintoanovelgeneinvolvedintumorprogression,metastasisandneurodegeneration[J].Pharmacology&therapeutics, 2007, 114(2):155-170

[4]BeesleyMF,MclarenKM.Cytokeratin19andgalectin-3immunohistochemistryinthedifferenialdiagnosisofsolitarythyroidnodules[J].Histopathology,2002,41(3):236-243

[5]YuC,ChenK,ZhengH,etal.Overexpressionofastrocyteelevatedgene-1(AEG-1)isassociatedwithesophagealsquamouscellcarcinoma(ESCC)progressionandpathogenesis[J].Carcinogenesis,2009, 30(5):894-901

[6]HuG,ChongRA,YangQ,etal.MTDHactivationby8q22genomicgainpromoteschemoresistanceandmetastasisofpoorprognosisbreastcancer[J].CancerCell,2009,15(1):9-20

[7]LeeSG,JeonHY,SuZZ,etal.AstrocyteElevatedGene-1contributestothepathogenesisofneuroblastoma[J].Onecogene,2009,28(26):2476-2484

[8]EmdadL,SarkarD,SuZZ,etal.Astrocyteelevatedgene- 1:recentinsightsintoanovelgeneinvolvedintumorprogression,metastasisandneurodegeneration[J].PharmacolPharmacolTher,2007,114(2):155-170

[9]胡明,刘振平,黄世杰,等.MMP-9在胃癌中的表达及与临床病理因素的关系[J]. 黑龙江医药科学, 2013,36(5):18-19

[10]王彩霞,王晓,吴庆田,等.MMP-26和Ki67在胃癌组织中的表达及临床意义[J]. 黑龙江医药科学,2012,35(4):83-84

宋瑒(1989～)女，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生。

王彩霞(1964～)女, 黑龙江佳木斯人,学士，主任医师，教授,硕士研究生导师。E-mail:wcx19641027@163.com。

R

A

1008-0104(2017)02-0128-02

2016-10-11)