川芎嗪阻滞细胞周期抑制MCF-7细胞增殖的初步研究①

宋庆娇，柳朝阳，王 迪，王维铭，杨 莹, 刘璐，张 涛

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007 )

川芎嗪阻滞细胞周期抑制MCF-7细胞增殖的初步研究①

宋庆娇，柳朝阳，王 迪，王维铭，杨 莹, 刘璐，张 涛

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007 )

目的：探讨川芎嗪阻滞细胞周期抑制细胞增殖抗乳腺癌机制。方法：MTT法检测川芎嗪对MCF-7细胞增殖抑制作用;PI单染法流式细胞术检测川芎嗪作用MCF-7细胞细胞周期分布。结果：不同浓度的川芎嗪作用MCF-7细胞24h、48h和72h可对MCF-7细胞的增殖产生直接抑制作用， 呈时间和剂量依赖性; 不同浓度的川芎嗪作用MCF-7细胞48h，川芎嗪诱导MCF-7细胞停滞于G1期，呈量效关系。结论：川芎嗪可通过诱导细胞周期阻滞抑制MCF-7细胞增殖。

川芎嗪; 细胞周期; 细胞增殖

乳腺癌的发病率全世界居女性恶性肿瘤之首。探讨中药防治乳腺癌机制是我国乳腺癌研究的重要任务。本研究以人乳腺癌细胞MCF-7为研究对象，观察川芎嗪对MCF-7细胞细胞周期和细胞增殖的影响。

1 材料和方法

1.1 细胞株、药品和试剂

中国医学科学院肿瘤研究所购买人乳腺癌MCF-7细胞。噻唑蓝(MTT)、 胎牛血清、DMEM培养基、青链霉素、胰蛋白酶和细胞周期检测试剂盒购于Sigma公司，川芎嗪购于北京中杉金桥生物公司。

1.2 方法

1.2.1MTT法检测川芎嗪对MCF-7细胞的生长抑制作用

胰酶消化MCF-7细胞(对数生长期)，制备2×105单细胞悬液接种培养24h后分别加入浓度为(0.25、0.5、1.0、2.0和4.0)mg/mL的川芎嗪，control组：无药物，有细胞与DMEM培养基和0.05%DMSO，在加药后的24h、48h和72h时分别取出培养板，MTT溶液10μL加入，37℃4h后，明显的蓝紫色颗粒结晶在阴性对照组中形成时，每孔加入150μLDMSO。570nm波长检测每孔吸光度值(Absorbance，A值)。

计算细胞生长抑制率=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。

1.2.2 流式细胞术检测川芎嗪对MCF-7细胞周期的影响

取对数生长期的MCF-7细胞，分别加入浓度为(0.25、0.5、1.0、2.0和4.0)mg/mL的川芎嗪，control组：有细胞、DMEM培养基、0.05DMSO，无药物，培养48h后用胰酶消化成单细胞悬液。

PI单染法检测细胞周期：每组取l×106个细胞，冰乙醇固定，4℃冰箱过夜，离心弃上清，PBS重悬2次，离心。固定细胞用PI溶液染色。暗箱培养1h。

细胞被荧光标记在流式细胞仪分选。用Multicycle软件分析细胞周期中不同阶段的细胞数目。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 川芎嗪对MCF-7细胞的生长抑制作用

MTT检测结果：与control组比，川芎嗪的不用浓度(0.25、0.5、1.0、2.0和4.0)mg/mL，24h、48h和72h分别作用MCF-7细胞，0.5mg/mL48h和72h细胞抑制率有显著差异(P<0.05，P<0.01)见表1。2.0mg/mL和4.0mg/mL的川芎嗪在48h细胞抑制率比较有显著差异(P<0.05)； 1.0mg/mL、2.0mg/mL和 4.0mg/mL的川芎嗪在48h与72h相比，细胞抑制率有显著差异(P<0.05),见表1。川芎嗪作用MCF-7细胞，可直接抑制MCF-7增殖，呈时间依赖性和剂量依赖性。

表1 川芎嗪对MCF-7细胞生长抑制作用±s)

与control组相比，*P<0.05,**P<0.01；与0.5mg/mL组相比，★P<0.05；与48h组相比，#P<0.05。

2.2 川芎嗪对MCF-7细胞周期的影响

细胞周期结果显示：川芎嗪(0.25、0.5、1.0、2.0和4.0)mg/mL作用MCF-7细胞48小时，与对照组(42.43%)相比，G0/G1期细胞所占百分比从47.32%随浓度递增依次增加至52.83%、59.60%、69.65%和80.11%，除0.25mg/mL外，G0/G1期百分率细胞递增，呈剂量依赖性(P<0.05，P<0.01)，G2/M期和S期细胞减少(见表2)，以上表明川芎嗪作用MCF-7细胞，可以使细胞发生G0/G1期阻滞。

表2 川芎嗪对MCF-7细胞周期分布的影响

与control组相比，*P<0.05,**P<0.01。

3 讨论

肿瘤细胞与正常细胞的区别是细胞不断增殖，因此，治疗恶性肿瘤的主要手段是抑制细胞增殖是。中药川芎萃取出来的单体生物碱川芎嗪，可以对微循环进行改善、对血液凝集进行抑制、扩血管等生物作用[1]。文献报道川芎嗪具有抗黑色素瘤、白血病、胃癌等作用[2，3]。

本研究表明，川芎嗪呈时间和剂量依赖性的对MCF-7细胞具有直接抑制增殖作用。 细胞增殖过程必须经历细胞周期，细胞周期可以分为G1期，S期，G2期和M期四个时期，在G1期细胞生物合成蛋白质和RNA，DNA分子的复制在S期进行。因为G2期是为M期的有丝分裂做准备，在这一期为保证准确复制DNA，进行必要的检查及修复。M期是分裂期，完成细胞分裂，在这一期平均分配遗传物质到子细胞中。 失去控制的增值生长作为肿瘤细胞的基本特征，一方面，细胞死凋亡数量减少，另外一方面细胞增殖和细胞去分化增加。肿瘤被理解为是细胞周期疾病，是因为众多的与肿瘤细胞发育有关的各种因素最终作用在控制细胞周期[4]。细胞增殖是被细胞周期调节控制的，G1/S期和G2/M期是细胞周期中调节细胞周期运行的关键调控点。文献报道，使肿瘤细胞在G2/M期聚集的中药有款冬花、侧柏叶、高良姜、银杏、姜黄等提取物，他们可以引发抗肿瘤作用[5～7]。

本试验表明，川芎嗪作用MCF-7细胞，改变细胞周期的分布，一方面。MCF-7细胞数在G0/G1期增加，呈剂量依赖性，另外一方面。MCF-7细胞在G2/M和S期细胞数目减少；这个结果说明川芎嗪可使细胞聚集在G1期，细胞不能进入S期进行DNA的复制和不能进入M期进行有丝分裂，这样就能导致肿瘤细胞增殖抑制和肿瘤细胞凋亡，所以我们认为川芎嗪抑制MCF-7细胞增值与其影响细胞周期分布有关。

[1]王建峰.丹参川穹嗪注射液治疗胶原诱导性关节炎大鼠的实验研究[J].黑龙江医药科学,2013,36(6)：23-24

[2]谢佐福,沈世仁.川芎嗪和羟基脲对阿霉素K562 细胞株DNA合成的影响[J].中华医学杂志,1997,73(9)：559-560

[3]刘锦蓉,叶松柏.川芎嗪抗肿瘤转移作用及其机制[J].中国药理学与毒理学杂志,1993,7(2)：149-152

[4]张涛,田黎明,王昭,等.白花败酱草对U14荷瘤鼠肿瘤细胞周期和PCNA表达的影响[J].黑龙江医药科学，2011,34(3):84-85

[5]WeiYQ,ZhaoX,KariyaY,etal.Inductionofapoptosisbyquercetin:involvementofheatshockprotein[J].CancerResearch,1994,54:4951-4957

[6]李嫔, 田国才, 林娜, 等. 广枣总黄酮对小鼠胸腺细胞凋亡及腺苷脱氧酶(ADA)活性的影响[J]. 中华微生物和免疫学杂志, 1998,18(6)：386-391

[7]薛妍, 夏天, 赵建斌, 等. 姜黄素对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用[J]. 第四军医大学学报, 2000,25(5):84-86

1.黑龙江省大学生创新创业训练计划项目，编号：201510222026；2. 佳木斯大学科基础研究类(自然类)面上项目，编号：JMSUJCMS2016-023；3.黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划项目，编号：1252G059。

宋庆娇(1996～)女，黑龙江肇东人，在校本科生。

张涛(1971～)女，黑龙江嘉荫人，博士，教授，硕士研究生导师。E-mail：ztlzy888@163.com。

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1008-0104(2017)02-0027-02

2017-02-08)