吡唑啉酮衍生物镉（Ⅱ）配合物体内外对黑素瘤B16细胞的抗肿瘤作用

常晨晨，吴 婷，2，汪梅芳，许贯诚，孙素荣

（新疆大学1.生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工程重点实验室，3.应用化学研究所，先进功能材料自治区重点实验室，新疆乌鲁木齐 830046；2.新疆维吾尔自治区人民医院，新疆乌鲁木齐 830002）

吡唑啉酮衍生物镉（Ⅱ）配合物体内外对黑素瘤B16细胞的抗肿瘤作用

常晨晨1，吴 婷1，2，汪梅芳1，许贯诚3，孙素荣1

（新疆大学1.生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工程重点实验室，3.应用化学研究所，先进功能材料自治区重点实验室，新疆乌鲁木齐 830046；2.新疆维吾尔自治区人民医院，新疆乌鲁木齐 830002）

目的研究吡唑啉酮镉（Ⅱ）配合物1-苯基-3-甲基-4-丙酰基-5-吡唑啉酮缩水杨酰肼-镉（Ⅱ）（Cd-PMPP-SAL）体内外对小鼠黑素瘤B16细胞的抗肿瘤作用及其作用机制。方法以Cd-PMPP-SAL 1.0，1.5，3.0，5.0和10.0 mg·L-1分别作用小鼠黑素瘤B16细胞24，48和72 h，采用MTT法检测B16细胞存活率；Cd-PMPP-SAL 6.25，12.50和25.00 mg·L-1作用B16细胞24 h，用Hoechst33258染色观察B16细胞形态，AnnenxinⅤ/PI双染色法检测B16细胞凋亡率；胱天蛋白酶活性检测试剂盒检测B16细胞内胱天蛋白酶活性。C57BL/6J小鼠皮下接种B16细胞制备荷瘤模型，5 d后分别瘤内注射Cd-PMPP-SAL 6.25，12.50和25.00 mg·kg-1，每天1次，连续12 d。每天检测体质量，给药结束后处死小鼠，测量瘤体积并测瘤质量，计算抑瘤率。HE染色法观察瘤体、肝和肺组织病理变化；免疫组织化学法检测肿瘤组织中血管内皮生长因子（VEGF）和成纤维细胞生长因子2（FGF2）蛋白表达；TUNEL法检测移植瘤组织内的细胞凋亡。结果Cd-PMPP-SAL抑制B16细胞存活，IC50为4.946 mg·L-1，95%置信限为4.24～5.65 mg·L-1；Cd-PMPP-SAL 12.50和25.00 mg·L-1作用24 h，B16细胞凋亡率为（12.8±1.4）%和（18.4±0.4）%，显著高于细胞对照组（1.7±0.1）（P＜0.01）；Cd-PMPP-SAL 25.00 mg·L-1组胱天蛋白酶3和9活性与细胞对照组比较显著增高（P＜0.01），胱天蛋白酶3/7活性变化不明显。瘤内注射Cd-PMPP-SAL 12.50和25.00 mg·kg-1治疗组，从治疗第8天起瘤体积与模型组相比明显减小（P＜0.01），对小鼠体质量无明显影响；Cd-PMPP-SAL 12.50和25.00 mg·kg-1治疗组小鼠移植瘤组织有不同程度的坏死，肝、肺组织无明显病理变化；与模型组比较，Cd-PMPP-SAL 12.50和25.00 mg·kg-1治疗组移植瘤组织VEGF和FGF2蛋白表达显著下降（P＜0.05），凋亡细胞明显增加（P＜0.05）。结论Cd-PMPP-SAL体内外可有效地抑制B16细胞生长，该作用可能与诱导细胞凋亡及抑制肿瘤内血管生成有关。

吡唑啉酮配合物；黑素瘤；细胞，B16；细胞凋亡

黑素瘤是一种恶性程度高、转移快的皮肤癌，可随血液和淋巴转移至全身各器官黏膜。目前，手术是其主要治疗方法，虽然手术可配合化疗和靶向治疗，但都有较大不良反应且有抗药性［1-2］。因此，寻求和开发更有效的抗癌药物或治疗途径就显得尤为重要。研究发现，许多非铂类金属配合物具有抗肿瘤活性［3-4］。对于非铂化疗金属药物研究主要集中在过渡金属Zn，Cu和Co等配合物。吡唑啉酮类配合物属于西佛（schiff）碱类化合物，是一类含有氮杂环的β二酮型化合物，能与不同金属形成多种类型的配合物。吡唑啉酮金属配合物比吡唑啉酮本身具有更强的抗菌［5-7］、抗病毒［8］和抗肿瘤［9-10］等活性。研究表明，一些酰基吡唑啉酮与金属离子螯合后能够对人及动物的肿瘤具有诱导凋亡作用［10］。吡唑啉酮衍生物金属配合物因具有合成简单、性质稳定、结构改造方便及生物学活性丰富的优点，其应用逐渐受到了重视［11］。研究发现，吡唑啉酮铜配合物能诱导人的口底癌KB细胞及多药耐药性的KBV200细胞凋亡［12］，其对小鼠急性毒性较低［13］。本课题组前期研究表明，吡唑啉酮镉（Ⅱ）配合物1-苯基-3-甲基-4-丙酰基-5-吡唑啉酮缩水杨酰肼-镉（Ⅱ）〔cadmium（Ⅱ）complex of pyrazolone deriv⁃atives，Cd-PMPP-SAL〕对人食管癌Eca-109细胞增殖的抑制作用比常用抗癌药物顺铂更好，能诱导细胞凋亡［14］，而对非瘤性的人胃上皮细胞和非洲绿猴肾细胞生长的抑制作用较弱［14-15］。本实验研究Cd-PMPP-SAL体内外对小鼠黑素瘤B16细胞增殖的抑制作用，探讨其抗肿瘤作用，为后续研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器

C57BL/6J小鼠，体质量18～22 g，雌性，购自新疆医科大学实验动物中心，使用许可证：SYXK（新）2016-0002，实验动物许可证号：SCXK（新）2016-0003。饲养环境温度为22～26℃，湿度为40%～60%，光照时间为12 h，自由采食饲料和水。Cd-PMPP-SAL为新疆大学应用化学研究所提供，经检测该配合物的纯度达质谱纯［14］。环磷酰胺（cy⁃clophosphamide，CTX）购自江苏盛迪医药有限公司；MTT、二甲亚砜（DMSO）、Hoechst33258染料、Dioc6（3）、DCFH-DA和RIPA细胞裂解液购自美国Sigma公司；凋亡检测试剂盒（AnnexinⅤ/PI）购于北京联科生物公司；胱天蛋白酶活性检测试剂盒购自江苏碧云天公司；胱天蛋白酶3，7和9均购于美国Cell Signaling公司；SV-0002两步法免疫组化试剂盒、TUNEL凋亡检测试剂盒、兔抗小鼠血管内皮生长 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、兔抗小鼠碱性成纤维细胞生长因子2（basic fibroblast growth factor 2，FGF2）和DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG抗体，购北京康为世纪生物科技有限公司；胎牛血清和RPMI 1640培养基购自赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；其他试剂均为分析纯。

Neofuge 13R高速离心机（中国香港Heal Force公司）；Benchmark plus酶标仪（美国Bio-Rad公司）；XD-101倒置显微镜（江南牌）（武汉欧卡科技有限公司）；3423型CO2培养箱（美国Themo公司）；流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 B16细胞培养

小鼠黑素瘤B16细胞（新疆大学生物资源基因工程重点实验室冻存）培养在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱内常规培养，取对数生长期细胞进行各项实验。Cd-PMPP-SAL充分溶解于DMSO后，加入RPMI 1640培养基或生理盐水配成400 mg·L-1母液，0.22 μm无菌滤器过滤，临用时用RPMI 1640培养基按所需比例稀释，DMSO的终浓度＜1%。

1.3 MTT法检测B16细胞存活

每孔5×107B16细胞接种于96孔板，过夜培养后分别加入Cd-PMPP-SAL，终浓度为1.0，1.5，3.0，5.0和10.0 mg·L-1，细胞对照组直接加入含DMSO的培养基，每孔100 μL，各组设3复孔。分别培养24，48和72 h后，每孔加入5 g·L-1的MTT 20 μL，继续孵育4 h后，弃上清，加入DMSO 150 μL，轻轻振荡10 min，待蓝紫色甲瓒结晶物完全溶解，于540 nm/655 nm双波长下测吸光度（A）值，细胞存活抑制率（%）=（药物处理组A540nm/655nm-对照组A540nm/655nm）/对照组A540nm/655nm×100%。用Logit法计算Cd-PMPP-SAL抑制B16细胞存活的IC50。

1.4 Hoechst33258染色观察B16细胞形态

取无菌洁净的盖玻片置于6孔板内，每孔接种1× 105B16细胞，过夜培养后分别加入Cd-PMPP-SAL，终浓度为6.25，12.50和25.00 mg·L-1；细胞对照组直接加入含DMSO介质的培养基，每孔10 μL，各组设3个复孔，继续孵育24 h后，弃去培养液，PBS洗涤，加入Hoechst33258染色液（0.5 mg·L-1）1 mL，染色5 min，PBS洗2次，每次3 min。滴1滴细胞培养液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，荧光显微镜下观察B16细胞形态。

1.5 AnnenxinⅤ/PI双染色法检测B16细胞凋亡率

以2×108L-1B16细胞接种于6孔板，每孔2 mL，分别加入Cd-PMPP-SAL，终浓度为6.25，12.50和25.00 mg·L-1，细胞对照组同1.4，各组设3复孔。培养24 h后，消化收集细胞，按AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书操作检测B16细胞凋亡率。

1.6 细胞内胱天蛋白酶活性的检测

以1×109L-1B16细胞接种于96孔板，每孔2 mL，分别加入Cu-PMPP-SAL，终浓度为6.25，12.50和25.00 mg·L-1，细胞对照组同1.4，各组设3复孔。培养24 h后细胞裂解处理，按照胱天蛋白酶活性检测试剂盒检测B16细胞内胱天蛋白酶的活性。

1.7 小鼠B16荷瘤模型的制备

取对数生长期B16细胞，用生理盐水调整细胞密度为2×109L-1，在6周龄C57BL/6J小鼠的背部皮下接种细胞悬液，每只0.25 mL。接种完成后，随机分为5组：模型对照组给予生理盐水10 mL·kg-1；阳性对照组给予CTX 10 mg·kg-1；Cd-PMPP-SAL治疗组分别给予Cd-PMPP-SAL 6.25，12.50和25.00 mg·kg-1，每组5只。小鼠接种肿瘤成功率为100%。5 d后肿瘤已长至约25 mm×25 mm× 25 mm，第6天开始采取瘤内注射给药，每日1次，连续12 d。小鼠每天检测体质量，隔日测量肿瘤最长径（a）和最短径（b），按下式计算肿瘤体积（tumor volume，V）与相对肿瘤体积（relative tumor volume，RV）：V=a×b2×0.5；RV=V/V0（V0：给药前肿瘤体积）。停药后剥取实体瘤，分别称重并计算抑瘤率。抑瘤率（%）=（模型对照组平均瘤质量-实验组平均瘤质量）/模型对照组平均瘤质量×100%。

1.8 小鼠组织病理观察

1.9 TUNEL法检测细胞凋亡

小鼠肿瘤组织石蜡切片，脱蜡后按照Ronch公司的细胞凋亡检测试剂盒操作，于200倍光镜下计数3个视野移植瘤组织内凋亡细胞密度。

1.10 免疫组化法检测瘤体内VEGF和FGF2的表达

小鼠肿瘤组织石蜡切片，脱蜡，加兔抗小鼠VEGF和FGF2抗体结合，使用HRP标记的山羊抗兔IgG二抗孵育，使用DAB显色，于显微镜下观察。实验步骤按照SV-0002两步法免疫组化试剂盒的使用说明书操作，细胞中VEGF和FGF2的表达与分布以棕染细胞为阳性表达［16］。先在100倍视野下观察整张组织切片的阳性细胞分布情况，确定肿瘤区域内阳性细胞最密集的3个区域。再在200倍光镜下计数每个区域内的阳性细胞数，取3个区域内200倍光镜下视野范围内细胞数的平均值作为该小鼠肿瘤组织VEGF和和FGF2表达水平。

1.11 统计学分析

实验结果数据以x±s表示，使用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行比较，用t检验进行组间两两比较。P＜0.05为差异具有统计学意义。

水利设施的使用寿命以及工程的整体效益均与施工质量有直接关系。当前在水利工程施工管理过程中，施工队伍综合素质较低、质量监督制度不完善、建设单位管理体系不健全等问题的存在对工程建设质量产生较大影响。因此，施工单位应采取切实有效的措施，进一步提高施工管理水平，确保工程建设质量。

2 结果

2.1 Cd-PMPP-SAL对黑素瘤B16细胞的抑制作用

2.1.1 对B16细胞存活的抑制作用

由图1可见，不同浓度Cd-PMPP-SAL分别处理B16细胞24，48和72 h，Cd-PMPP-SAL对B16细胞存活的抑制率随着浓度增高和作用时间延长而升高。采用Logit法计算Cd-PMPP-SAL作用72 h抑制B16细胞存活的IC50为4.946 mg·L-1，95%置信区限为4.24～5.652 mg·L-1。

Fig.1 Inhibitory effect of cadmium（Ⅱ）complex of pyrazolone derivatives（Cd-PMPP-SAL）on B16 cell survival detected by MTT method.IC50for 72 h was 4.946 mg·L-1.，n=3.

2.1.2 对B16细胞凋亡的诱导作用

Hoechst33258染色结果（图2）所示，细胞对照组细胞饱满，轮廓清晰，细胞着色较淡。与对照组相比，Cd-PMPP-SAL 6.25 mg·L-1作用B16细胞24 h后，细胞着色无明显差别；12.50 mg·L-1组细胞数量减少，体积变小，微绒毛消失，核浆比例增大；25.00 mg·L-1组细胞核物质致密，呈斑块状，边集于核膜，有的断裂成大小不一的圆形颗粒，甚至出现自体吞噬泡，呈现出凋亡细胞特有的特性，表明B16细胞出现凋亡。

Fig.2 Morphology of B16 cells treated by Cd-PMPPSAL 25.00 mg·L-1for 24 h with Hoechst33258 stain⁃ing.The red arrows point to the apoptotic bodies.

采用Annexin-Ⅴ/PI双染法检测Cd-PMPP-SAL诱导B16细胞凋亡作用，结果显示（图3），Cd-PMPPSAL 12.50和25.00 mg·L-1作用B16细胞24 h，B16细胞凋亡率显著高于细胞对照组（P＜0.01）。

Fig.3 Inducing effect of Cd-PMPP-SAL on apoptosis of B16 cells detected by Annexin-V/PI staining.B16 cells were incubated with Cd-PMPP-SAL for24 h.A：Annexin-V/ PI staining；B：the quantitative results of A.n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0.00）group.

2.1.3 对B16细胞内胱天蛋白酶活性的影响

表1结果表明，与细胞对照组相比，Cd-PMPPSAL 12.50和25.00 mg·L-1组胱天蛋白酶3和9活性显著增高（P＜0.05，P＜0.01），而胱天蛋白酶3/7活性变化不明显。提示Cd-PMPP-SA诱导B16细胞凋亡可能与激活胱天蛋白酶3和9信号通路有关。

Tab.1 Effect of Cd-PMPP-SAL on caspases activity in B16 cells

2.2 Cd-PMPP-SAL对B16荷瘤小鼠的抗肿瘤作用

2.2.1 对B16移植瘤生长的抑制作用

连续瘤内注射Cd-PMPP-SAL或CTX治疗12 d后，模型对照组、CTX组及Cd-PMPP-SAL 3个剂量组小鼠体质量（减去处死后小鼠体内肿瘤质量）与给药前相比均未明显下降，表明Cd-PMPP-SAL对小鼠体质量无明显的不良反应（图4）。

Fig.4 Effect of Cd-PMPP-SAL on body mass of B16 tumor-bearing mice.Mice were injected B16 cells at the back.Five days later，when the tumor was about 25 mm×25 mm× 25 mm，cyclophosphamide 10 mg·kg-1or Cd-PMPP-SAL 6.25，12.50 and 25.00 mg·kg-1was injected into the tumors once daily for 12 d.，n=5.

由图5可见，给药期间，与第0天瘤体积相比，模型组小鼠相对瘤体积增长迅速，明显增加（P＜0.05）；Cd-PMPP-SAL 3个剂量组从治疗第8天起瘤体积明显小于模型对照组（P＜0.01）；Cd-PMPP-SAL 25.00 mg·kg-1治疗12 d后，相对瘤体积与第1天相比无明显增加。表明Cd-PMPP-SAL对小鼠肿瘤生长有显著抑制作用。

Fig.5 Effect of Cd-PMPP-SAL on relative tumor volume of B16 tumor-bearing mice.See Fig.4 for the mouse treat⁃ment.Relative tumor volume=post-experiment tumor volume/ pre-experiment tumor volume.，n=5.＊P＜0.05，compared with the 0 day of model group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

由表2可见，Cd-PMPP-SAL12.50和25.00mg·kg-1治疗12 d后，移植瘤瘤重与模型对照组相比显著减少（P＜0.01），与CTX阳性对照组作用趋势一致。

Tab.2 Inhibition of Cd-PMPP-SAL on growth of mela⁃noma in B16 tumor-bearing mice

2.2.2 Cd-PMPP-SAL对小鼠移植瘤和肝、肺组织病理变化的影响

小鼠移植瘤组织石蜡切片结果显示（图6），模型对照组肿瘤组织致密，可见许多血管切面，微血管广泛分布于肿瘤组织间质内。Cd-PMPP-SAL 12.50和25.00 mg·kg-1治疗组小鼠瘤体内可见到不同程度的点、片状坏死，细胞间隙增大，血管数量减少，CTX对照组上述组织病理变化与Cd-PMPP-SAL组相似。Cd-PMPP-SAL治疗组小鼠肝、肺组织的细胞分布均匀，未见明显病理改变，表明Cd-PMPPSAL治疗12 d对移植瘤小鼠肝、肺组织无明显损伤（图略）。

Fig.6 Histological changes in tumor tissue from B16 tumor-bearing mice（HE，200×）.See Fig.4 for the mouse treatment.The red arrows point to the site of tissue necrosis and enlargement of intercellular space.

2.2.3 对小鼠移植瘤组织细胞凋亡的影响

TUNEL检测结果表明（图7），Cd-PMPP-SAL治疗组的移植瘤组织内细胞染色加深，说明凋亡细胞数量增多。结果显示，Cd-PMPP-SAL 12.50和25.00 mg·kg-1治疗组凋亡细胞密度为47±4和89±5，与模型对照组（26±4）相比，Cd-PMPP-SAL治疗组移植瘤组织内凋亡细胞均显著升高（n=5，P＜0.05）。

Fig.7 Determination of apoptosis of cells in tumor tis⁃sues from B16 tumor-bearing mice by TUNEL（200×）. The red arrows point to apoptosis cells.

2.2.4 对小鼠移植瘤组织中VEGF和FGF2蛋白表达的影响

免疫组化结果显示（图8），治疗组和阳性对照组移植瘤组织VEGF及FGF2蛋白表达较低、细胞着色淡。200倍光镜下计数3个视野移植瘤组织内VEGF和FGF2阳性细胞。结果显示，模型组、Cd-PMPP-SAL 12.50和25.00 mg·kg-1治疗组VEGF密度分别为95±4，40±5和26±4，FGF2密度分别为81±11，30±7和20±9；与模型组相比，Cd-PMPP-SAL治疗组VEGF和FGF2细胞密度均显著降低（n=5，P＜0.05）。说明Cd-PMPP-SAL对VEGF和FGF2可能具有一定的抑制作用，提示血管生成障碍可能是细胞凋亡的原因之一。

Fig.8 Expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）and fibroblast growth factor 2（FGF2）in tumor tissues from B16 tumor-bearing mice by immunohistochemistry（200×）.See Fig.4 for the mouse treatment.The red arrows point to VEGF and FGF2 positive cells，respectively.

3 讨论

恶性黑素瘤具有转移快、预后差的特点，而实体肿瘤迁移的主要原因是肿瘤细胞进入血液系统，与血液成分相互作用，内皮细胞黏附而导致转移［17-19］，目前仍无十分有效的方法进行治疗。

有机金属配合物结构多样，可选择多样的配体，对开发筛选出高生物活性，低毒性小分子化合药物提供了可能［20-22］。Riccardo等［23］报道，吡唑啉酮衍生物金属配合物β-酮胺钌（Ru）芳烃配合物对卵巢癌细胞具有抗肿瘤活性。Leovac等［24］研究表明，吡唑啉酮类化合物可克服顺铂等传统药物的毒副作用及耐药性。本课题组前期已合成并测定了5种吡唑啉酮金属配合物的活性。研究结果表明，Cd-PMPPSAL有显著的杀菌抗肿瘤活性，且影响DNA紫外吸收光谱［25］。吴婷等［15］发现，Cd-PMPP-SAL对Eca109细胞有体外抗增殖活性，能够诱导细胞早期凋亡。本研究以Cd-PMPP-SAL 6.25，12.50和25.00 mg·L-1分别作用 B16细胞24 h后，发现随着药物浓度增大，细胞的贴壁性下降，数量变少，Hoechst33258荧光染料的染色加深，25.00 mg·L-1处理的细胞出现了典型的凋亡小体。由胱天蛋白酶体外活性检测结果发现，Cd-PMPP-SAL 25.00 mg·L-1处理组的细胞中胱天蛋白酶3和9的活性与对照相比显著上调，提示细胞凋亡可能与胱天蛋白酶的激活有关。

目前，关于吡唑啉酮金属配合物在体内的抗肿瘤作用鲜有报道。本研究利用B16细胞制备了C57小鼠皮下肿瘤模型，采用瘤体内注射的方式用Cd-PMPP-SAL对小鼠肿瘤进行12 d治疗。结果表明，Cd-PMPP-SAL 25.00 mg·kg-1组小鼠的抑瘤率达到（22.2±2.4）%，说明Cd-PMPP-SAL具有较强的抗肿瘤作用。同时治疗期间小鼠没有明显的食欲下降现象，体质量也没有明显的下降趋势。对移植瘤组织的病理观察结果显示，小鼠经Cd-PMPP-SAL治疗后，致密的肿瘤组织结构变得稀疏，血管数量减少，细胞间隙变大，说明移植瘤组织受到了一定程度的损害，肿瘤组织中血管数量减少可能是Cd-PMPP-SAL抗肿瘤细胞增殖的重要原因之一。而小鼠肝、肺组织形态没有明显的病理变化，说明Cd-PMPP-SAL对小鼠的肝、肺组织没有明显的损伤。本课题组前期的体外实验也表明，Cd-PMPP-SAL对非洲绿猴肾细胞和人胃上皮细胞的增殖影响较小［14-15］，推测Cd-PMPP-SAL毒副作用低，对实验小鼠机体损伤较小。

VEGF是最先被发现的促淋巴管生长因子，可促进血管和淋巴管的生成［26-27］。FGF2在很多恶性肿瘤中呈高表达，可通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B等信号通路诱导肿瘤细胞血管的生成，肿瘤的生长和转移很大程度上依赖肿瘤血管的形成［27-28］。已有研究表明，通过介导磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路抑制VEGF以及FGF2的表达从而抑制肿瘤细胞的复发和转移［29-31］。为了进一步研究Cd-PMPP-SAL对血管生成的影响，本研究检测其是否对血管生成的重要蛋白VEGF以及FGF2具有调节作用。免疫组化实验结果表明，Cd-PMPP-SAL治疗组VEGF和FGF2的表达显著低于模型组，说明Cd-PMPP-SAL抑制肿瘤生长的作用机制可能与下调VEGF和FGF2的表达，从而减少肿瘤组织间血管生成有关。采用TUNEL法特异性地检测Cd-PMPP-SAL对小鼠体内实体瘤细胞的诱导凋亡作用。结果显示，经Cd-PMPP-SAL治疗小鼠的肿瘤切片呈细胞深染，而模型对照组细胞染色较浅，说明经Cd-PMPP-SAL治疗的小鼠肿瘤细胞发生凋亡。

综上所述，Cd-PMPP-SAL于体内外均可显著抑制B16细胞增殖，其作用机制可能与下调VEGF和FGF2蛋白表达、抑制瘤体血管生成并诱导细胞凋亡有关。荷瘤小鼠对Cd-PMPP-SAL治疗没有严重的不良反应，这一研究结果可为临床黑素瘤化疗提供一个有价值的治疗方案，值得进一步研究和探讨。

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Antitumor effect of cadmium(Ⅱ)complex of pyrazolone derivatives on melanoma B16 cells in vitro and in vivo

CHANG Chen-chen1,WU Ting1,2,WANG Mei-fang1,XU Guan-cheng3,SUN Su-rong1

(1.Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering,College of Life Science and Technology;3.Key Laboratory of Advanced Functional Material,Institute of Applied Chemistry, Xinjiang University,Urumqi 830046,China;2.People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830002,China)

OBJECTIVETo investigate the antitumor effect of cadmium(Ⅱ)complex of pyrazolone derivatives 1-phenyl-3-methyl-4-propionyl-5-pyrazolone salicyloyl hydrazide-cadmium(Ⅱ)(Cd-PMPPSAL)on the murine melanoma B16 cellsin vitroandin vivoand its mechanisms.METHODSB16 cells were incubated with Cd-PMPP-SAL at 1.0,1.5,3.0,5.0 and 10.0 mg·L-1for 24,48 or 72 h.The prolifera⁃tion rate of B16 cells was evaluated by MTT assay.B16 cells were incubated with Cd-PMPP-SAL at 6.25, 12.50 and 25.00 mg·L-1for 24 h,while cell morphology was observed by Hoechst33258 staining.Apop⁃tosis of B16 cells was detected by AnnexinⅤ-FITC/PI staining.The activity of caspases in B16 cells was detected by caspase activity assay.C57BL/6J mice were inoculated subcutaneously with B16 cells to establish a tumor-bearing model.Five days later,Cd-PMPP-SAL at 6.25,12.50 and 25.00 mg·kg-1was injected into tumors of C57BL/6J mice once a day for 12 d.The body mass was recorded daily. One day after the last administration,all the mice were killed and the tumor was harvested.Tumor volume and mass were measured,and the tumor inhibitory rates were calculated.Pathological changes of the tumor,liver and lung were observed under a microscope.The expressions of vascular endothelial growth factor(VEGF)and fibroblast growth factor 2(FGF2)in tumor tissues were detected by immuno⁃histochemistry.The apoptotic cells in transplanted tumor tissues were detected by TUNEL.RESULTSCd-PMPP-SAL inhibited the proliferation of B16 cells.The IC50was 4.946 mg·L-1,and 95%confidence interval was 4.24-5.65 mg·L-1.The apoptosis rates(12.8±1.4)%and(18.4±0.4)%of Cd-PMPP-SAL 12.50 and 25.00 mg·L-1groups were significantly higher than those of control group(1.7±0.1)%(P＜0.01).The activity of caspase 3 and 9 of Cd-PMPP-SAL 25.00 mg·L-1group was significantly higher than that of control group(P＜0.01),but there was no significant difference in caspases 3/7.The relative tumor volumes of Cd-PMPP-SAL 6.25,12.50 and 25.00 mg·kg-1treated groups from the 8thday of treatment were significantly decreased compared with the model group(P＜0.01).The result of paraffin sections showed that the transplanted tumor tissues in Cd-PMPP-SAL 12.50 and 25.00 mg·kg-1groups exhibited different degrees of necrosis,but there was no significant pathological damage to the liver or lung tissues of mice.Compared with model group,expressions of VEGF and FGF2 in Cd-PMPP-SAL 12.50 and 25.00 mg·kg-1treated groups were significantly inhibited(P＜0.05),and apoptotic cell rates were significantly higher(P＜0.05).CONCLUSIONCd-PMPP-SAL can inhibit growth of B16 cellsin vivoandin vitro,which may be associated with induction of tumor cell apoptosis and inhibition of tumor angiogenesis.

pyrazolone derivative;melanoma;cells,B16;apoptosis

The project supported by Natural Science Fund of Xinjiang Uygur Autonomous Region(2013211A018)

SUN Su-rong,Tel:(0991)8582077,E-mail:sr_sun2005@163.com

R979.1

：A

：1000-3002-（2017）05-0405-09

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.05.005

2016-09-21 接受日期：2017-05-05）

（本文编辑：齐春会）

新疆维吾尔自治区自然科学基金（2013211A018）作者简介：常晨晨，女，硕士研究生，主要从事生物化学与分子生物学研究，E-mail：528193074@qq.com；孙素荣，女，教授，硕士生导师，主要从事基因工程与药物筛选研究。

孙素荣，E-mail：sr_sun2005@163.com，Tel：（0991）8582077