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电针联合身痛逐瘀胶囊对CCI大鼠脊髓组织TNF-α,IL-1β,IL-6表达的影响

2017-06-05金弘刘婷婷刘树民陈英华孙晓伟朴圣爱祝鹏宇

中医药信息 2017年3期
关键词:身痛针药神经病

金弘,刘婷婷,刘树民,陈英华,孙晓伟,朴圣爱,祝鹏宇

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040;3.黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江 哈尔滨 150001)

电针联合身痛逐瘀胶囊对CCI大鼠脊髓组织TNF-α,IL-1β,IL-6表达的影响

金弘1,刘婷婷2*,刘树民2,陈英华1,孙晓伟1,朴圣爱1,祝鹏宇3

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040;3.黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江 哈尔滨 150001)

目的:通过观察电针联合身痛逐瘀胶囊对CCI大鼠热缩足反射潜伏期以及脊髓组织TNF-α、IL-1β、IL-6表达的影响,以期从调控脊髓组织促炎性细胞因子角度揭示其作用机制。方法:成年SD大鼠按照随机数字表分为假手术组、模型组、电针组、中药组和针药组,每组分为3天、7天和14天三个亚组,每个亚组10只大鼠。按照Bennett的方法建立CCI大鼠模型,电针组给予损伤侧环跳、阳陵泉电针治疗,每日1次,每次30 min。中药组给予身痛逐瘀胶囊治疗(1.64 g/kg),灌胃给药,给药容积为15 ml/kg,每日1次。针药组给予电针和中药联合治疗,方法及疗程同上。假手术组和模型组给予等容积生理盐水灌胃。采用热缩足反射潜伏期进行大鼠行为学检测;采用ELISA法检测CCI模型大鼠脊髓组织TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达。结果:模型组大鼠TWL术后3天即达到最低值,此后稍有延长,但仍显著低于术前,术后各时间点与假手术组相比具有显著性差异(P<0.05);电针组、中药组、针药组CCI大鼠热缩足反射潜伏期有所延长,各时间点与模型组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。针药组大鼠机械缩足反射阈值显著上升,与电针组、中药组相比,疗效更加显著(P<0.05)。ELISA检测结果显示,模型组术后各时间点脊髓组织中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白含量显著升高(P<0.05),与假手术组比较差异显著(P<0.05)。治疗后电针组、中药组、针药组脊髓组织中TNF-α、IL-1β和 IL-6蛋白含量明显降低(P<0.05),与模型组相比差异显著(P<0.05)。治疗后针药组TNF-α、IL-1β和 IL-6蛋白含量明显降低(P<0.05),与电针组、中药组比较差异显著(P<0.05)。以上结果表明,电针组、中药组、针药组均能抑制CCI模型大鼠脊髓组织TNF-α、IL-1β和 IL-6蛋白表达,尤以针药组疗效更佳。结论:电针联合身痛逐瘀胶囊能够显著改善CCI模型大鼠热缩足反射潜伏期,其作用机制可能与其抑制脊髓组织中促炎性因子TNF-α、IL-1β和 IL-6表达上调有关。

神经病理性疼痛;电针;身痛逐瘀胶囊;促炎性细胞因子

神经病理性疼痛是指由中枢神经系统、背根神经结、背根及周围神经在内的神经系统受到刺激或者损伤而出现的非生理性疼痛[1]。神经病理性疼痛是目前临床慢性疼痛的主要原因之一[2],因其对患者的生活造成较大的影响,已成为目前临床较为棘手的疾病之一。神经病理性疼痛尚缺乏有效的治疗方法,目前可供选择的常用的治疗方法主要包括非甾体类抗炎药、阿片类止痛药、抗抑郁药以及局麻药等,但多具有止痛效果差,容易反复以及不良反应多等缺点[3]。针灸和中药治疗坐骨神经痛因其疗效显著且副作用小,越来越得到临床广泛认可。笔者自2014年至今采用电针联合身痛逐瘀汤治疗坐骨神经痛患者,取得满意疗效,然而其作用机制尚不明确。因此,进一步揭示电针联合身痛逐瘀汤治疗神经病理性疼痛的作用机制可为其更好的临床应用提供理论基础。

目前,大量研究发现,神经病理性疼痛的发生、发展过程中,中枢神经系统促炎性细胞因子的释放可能起重要作用[4]。本研究拟建立神经病理性疼痛大鼠模型,观察电针联合身痛逐瘀汤对CCI大鼠热缩足反射潜伏期以及脊髓组织TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达的影响,探讨其可能的作用机制,为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选用清洁级健康成年雄性SD大鼠150只,体质量(250±30)g,由黑龙江中医药大学动物实验中心提供(动物合格证号SCXK(黑)2008004 )。动物在实验室适应性饲养1周后,采用随机数字表法将实验大鼠分为5组,即假手术组、模型组、电针组、中药组、针药组,每组30只。每组又分为3天、7天、14天三个亚组,每个亚组10只大鼠。

1.2 主要实验仪器和试剂

热痛刺激仪(BME-410A型,中国医学科学院生物工程研究所,中国);恒温箱(苏州医疗设备厂,中国);高速离心机(CS-15R,美国Beckman);华佗针灸针(苏州医疗设备厂,中国);电针仪(KWD-801,中国英迪);TNF-α、IL-1β、IL-6试剂盒(北京中杉公司);身痛逐瘀胶囊(规格:0.35 g/粒,黑龙江中医药大学中医药研究院,批号 20110513)。

1.3 动物模型制备

按照Bennett的方法[5]建立CCI模型,大鼠称重后,腹腔注射水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉,俯卧,用橡皮筋固定四肢于自制的鼠板上,用弯剪刀将左侧后肢大腿部剃毛后用碘伏消毒,在大鼠左侧股骨中上1/3处行纵形切口,钝性分离局部肌肉,暴露并分离坐骨神经主干,选择4-0号铬制羊肠线在坐骨神经主干部位结扎4道,两道之间间隔约1.0 mm,然后逐层缝合皮肤肌肉。假手术组大鼠暴露坐骨神经主干后,不进行结扎,逐层缝合皮肤肌肉。

1.4 治疗方法

假手术组:术后大鼠常规饲养,直至相应时间点实验结束,其余未经任何治疗。模型组:术后大鼠常规饲养,直至相应时间点实验结束,其余未经任何治疗。电针组:选穴环跳、阳陵泉(损伤侧);依据大鼠穴位图谱确定环跳穴及阳陵泉穴定位,针具和穴位局部皮肤常规消毒后,选用华佗牌一次性针灸针(0.25 mm×25 mm),快速进针,同侧环跳和阳陵泉穴接电针仪,上正下负,选择疏密波[6],频率为2 Hz/100 Hz,电流强度以局部肌肉轻微颤动为度,每日1次,每次留针30 min。中药组[7]:取身痛逐瘀胶囊囊心药粉1.64 g加生理盐水溶解为100 ml,制成身痛逐瘀胶囊混悬液,灌胃给药,给药容积为15 ml/kg,每日1次,连续治疗相应疗程。针药组:给予电针和中药联合治疗,方法及疗程同上。

保证动物饲养室温度为21~24℃,室内湿度50%~70%, 12 h交替照明,自由进食和饮水。各组大鼠分笼饲养,每笼4~5只大鼠。各组分别于术后3 d,7 d,14 d进行行为学检测及取材。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL)的测定[8]

将透明有机玻璃箱放置在一个玻璃板上,检测前30 min,将大鼠置于玻璃箱内适应环境和温度。保持室温在(25±1)℃,待大鼠适应30 min后,用BME-410A型热辐射刺激仪照射大鼠足底,记录热辐射刺激仪照射开始时间,再记录大鼠出现抬腿回避的时间,该时间即为热缩足反射潜伏期,两次照射间隔25 s后再进行下一次检测,每只大鼠检测3次,两次照射间隔2 min,取其平均值。

1.5.2 动物取材及检测

各组大鼠分别在术后3天、7天和14天行为学检测后,用10%水合氯醛腹腔麻醉(3.5 mg/kg),迅速开胸,暴露心脏,将注射器针头快速插入左心室,固定针头后缓慢注入生理盐水,直至清澈透亮的液体自右心耳流出,接着用注射器缓慢注入4%多聚甲醛溶液,直至大鼠出现四肢抽搐,皮肤、肺脏、肝脏及眼睑变白等表现,迅速断头,取出大鼠腰膨大部位的脊髓(相当于L4-L6脊髓),长度大约1.5 cm,迅速置于液氮中,-80℃保存备用,每组取材6只。

ELISA法检测CCI大鼠脊髓组织TNF-α、IL-1β、IL-6的表达:取出保存备用的脊髓组织,放置于预先配置好的组织匀浆液中,用匀浆器在4℃下匀浆,然后用离心机离心,20 000×g离心30 min,取出上清液,按照ELISA试剂盒说明书操作,检测TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的含量。

1.6 统计学处理

2 实验结果

2.1 热缩足反射潜伏期检测结果

结果表明,模型组大鼠TWL术后3天即达到最低值,此后稍有延长,但仍显著低于术前,术后各时间点与假手术组相比具有显著差异(P<0.05);电针组、中药组、针药组CCI大鼠热缩足反射潜伏期有所延长,各时间点与模型组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。针药组大鼠机械缩足反射阈值显著上升,与电针组、中药组相比,疗效更加显著(P<0.05)。详见表1。

表1 各组CCI大鼠热缩足反射潜伏期检测结果

注:与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与电针组比较,#P<0.05;与中药组比较,○P<0.05。

2.2 各组大鼠脊髓组织TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的表达

2.2.1 各组大鼠脊髓组织TNF-α的表达

结果显示,模型组术后各时间点脊髓组织中TNF-α蛋白含量显著升高(P<0.05),术后7天时达到表达高峰,与假手术组比较差异显著(P<0.05)。治疗后电针组、中药组、针药组脊髓组织中TNF-α蛋白含量明显降低(P<0.05),与模型组相比差异显著(P<0.05)。治疗后针药组TNF-α蛋白含量明显降低(P<0.05),与电针组、中药组比较差异显著(P<0.05)。以上结果表明,电针组、中药组、针药组均能抑制脊髓组织TNF-α蛋白表达,但针药组的治疗优势更加明显,疗效显著。详见表2。

表2 各组CCI大鼠脊髓组织TNF-α蛋白表达

注:与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与电针组比较,#P<0.05;与中药组比较,○P<0.05。

2.2.2 各组大鼠脊髓组织IL-1β的表达

结果显示,模型组术后各时间点脊髓组织中IL-1β蛋白含量显著升高(P<0.05),于术后7天达到高峰,与假手术组比较差异显著(P<0.05)。治疗后电针组、中药组、针药组脊髓组织中IL-1β蛋白含量明显降低(P<0.05),与模型组相比差异显著(P<0.05)。治疗后针药组IL-1β蛋白含量明显降低(P<0.05),与电针组、中药组比较差异显著(P<0.05)。以上结果表明,电针组、中药组、针药组均能抑制脊髓组织IL-1β蛋白表达,尤以针药组疗效更加显著。详见表3。

表3 各组CCI大鼠脊髓组织IL-1β蛋白表达

注:与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与针刺组比较,#P<0.05;与中药组比较,○P<0.05。

2.2.3 各组大鼠脊髓组织IL-6的表达

结果显示,模型组术后各时间点脊髓组织中IL-6蛋白含量显著升高(P<0.05),一直持续至术后14天,与假手术组比较差异显著(P<0.05)。治疗后电针组、中药组、针药组脊髓组织中IL-6蛋白含量明显降低(P<0.05),与模型组相比差异显著(P<0.05)。治疗后针药组IL-6蛋白含量明显降低(P<0.05),与电针组、中药组比较差异显著(P<0.05)。以上结果表明,电针组、中药组、针药组均能抑制脊髓组织IL-6蛋白表达,尤以针药组疗效更佳。详见表4。

表4 各组CCI大鼠脊髓组织IL-6蛋白表达

注:与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与针刺组比较,#P<0.05;与中药组比较,○P<0.05。

3 讨论

坐骨神经痛是临床常见的神经病理性疼痛之一,中医学将坐骨神经痛归属于“痹症”和“腰腿痛”的范畴[9-10]。中医学认为,该病主要累及足太阳和足少阳两经,因此临床治疗多遵循循经取穴的原则,以足太阳和足少阳两经经穴为主。本研究选择上述两经的环跳和阳陵泉为主穴,并给予电刺激治疗。现代研究表明,电刺激具有较好的抗炎镇痛作用,其中低频率的电刺激能够引起脑垂体释放β内啡肽和脑啡肽增多,两者可以分别作用于μ和δ受体而起到镇痛作用,但作用较为缓慢持久;而高频率的电刺激能够引起脊髓释放强啡肽增多,从而作用于κ受体,产生即时的镇痛作用[11],因此本研究选择疏密波治疗,以最大程度的改善疼痛症状。既往研究也发现[6,12],电针疏密波能够显著上调急性痛风性关节炎模型大鼠足踝关节滑膜内HSP70蛋白表达,达到减轻局部炎症反应、缓解疼痛的作用,疗效优于疏波和密波。身痛逐瘀胶囊是清代名医王清任在《医林改错》中所载的身痛逐瘀汤制成的成方制剂,方中川芎、桃仁、当归和红花具有活血化瘀之功效;地龙、牛膝、秦艽、羌活和五灵脂具有活血化瘀并能强筋止痛的作用;香附具有调经活血、理气疏肝之效;没药能够消肿生肌并活血止痛;甘草调和诸药,并能清热解毒、祛痰止痛。诸药合用,共奏活血化瘀、通络止痛之功效[13]。现代研究表明,身痛逐瘀汤能够显著下调冰醋酸和福尔马林诱导的疼痛小鼠血清中MDA、NO以及PGE2的水平,上调SOD的水平,从而发挥中枢和外周镇痛作用[7]。

研究表明,疼痛与神经免疫功能密切相关,而促炎细胞因子以及趋化因子等则会作为慢性病理性疼痛之间的桥梁作用,对神经病理性疼痛的发展发挥重要的作用[14]。以TNF-α、IL-1β和 IL-6为代表的促炎细胞因子越来越被认为与神经病理性疼痛的发生关系密切。临床研究表明[15-16],骨关节炎性痛患者疼痛程度和血浆中促炎性细胞因子的水平成正比,在复合性局部疼痛综合征患者中也得出类似研究结果。TNF-α能够直接和其受体结合,从而触发一系列复杂的反应,包括激活痛觉传入纤维相关下游信号转导通路以及受体和离子通道等,诱发以缓激肽和神经营养因子为代表的其他细胞因子产生和释放,增强突触对刺激的敏感性[17-18]。IL-1β是由活化的巨噬细胞产生,为IL-1主要成员之一,有研究表明,IL-1β参与了疼痛的发生。IL-6是另一种主要参与细胞增殖和分化等功能的多潜能促炎性细胞因子,能够调节神经系统与免疫系统的功能,研究表明其与神经病理性疼痛的发生具有极大的相关性[19]。本实验研究结果证实,模型组术后各时间点脊髓组织中TNF-α、IL-1β和 IL-6蛋白含量显著升高(P<0.05),与假手术组比较差异显著(P<0.05)。治疗后电针组、中药组、针药组脊髓组织中TNF-α、IL-1β和 IL-6蛋白含量明显降低(P<0.05),与模型组相比差异显著(P<0.05)。治疗后针药组TNF-α、IL-1β和 IL-6蛋白含量明显降低(P<0.05),与电针组、中药组比较差异显著(P<0.05)。以上结果表明,电针组、中药组、针药组均能抑制CCI模型大鼠脊髓组织TNF-α、IL-1β和 IL-6蛋白表达,尤以针药组疗效更佳。

综上所述,电针联合身痛逐瘀胶囊能够显著改善CCI模型大鼠热缩足反射潜伏期,其作用机制可能与其抑制脊髓组织中促炎性因子TNF-α、IL-1β和 IL-6表达上调有关。

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Effect of Electroacupuncture Combined with Shentong Zhuyu Capsule on Expression of TNF-α, IL-1β and IL-6 in Spinal Cord Tissue of CCI Rats

JIN Hong1,LIU Ting-ting2*,LIU Shu-min2,CHEN Ying-hua1,SUN Xiao-wei1,PIAO Shen-ai1,ZHU Peng-yu3

(1.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040, China;3.The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150001, China)

Objective: To observe the effect of electroacupuncture combined with Shentong Zhuyu capsule on the latent period of heat shock reflex and the expression of TNF-α, IL-1β and IL-6 in CCI rats, and to explore the mechanism. Methods: Adult SD rats were randomly divided into sham operation group, model group, electroacupuncture group, traditional Chinese medicine group and acupuncture group. Each group was divided into three subgroups: 3 days, 7 days and 14 days with 10 rats in each subgroup. According to Bennett method establish CCI rat models,and electroacupuncture group

Sunshang Cehuan Tiao, Yanglingquan electroacupuncture treatment, once a day with 30 min. Chinese medicine group received Shentong Zhuyu capsules (1.64 g/kg), administered by intragastric administration,with volume of 15ml/kg, once a day. Acupuncture and medicine group received acupuncture and traditional Chinese medicine treatment,with the same method and course above. Sham operation group and model group were given equal volume of saline. The expressions of TNF-α, IL-1β and IL-6 protein in the spinal cord of CCI model rats were detected by ELISA. The expressions of TNF-α, IL-1β and IL-6 protein in the spinal cord of CCI model rats were detected by ELISA. Results: The acupuncture and medicine group was significantly lower than the sham operation group (P<0.05). The model group was significantly lower than the sham operation group (P<0.05). The latency of heat shock reflex in CCI rats was significantly higher than that in model group (P<0.05) and the effect of acupuncture and medicine group was significantly superior to that of acupuncture group and traditional Chinese medicine group (P<0.05). The levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the spinal cord tissue were significantly increased (P<0.05), and there was a significant difference between two groups (P<0.05). The levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in spinal cord tissue of acupuncture and medicine group, traditional Chinese medicine group and acupuncture and medicine group were significantly lower than those in model group (P<0.05). The levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the acupuncture and medicine group were significantly lower than those in the acupuncture group and the traditional Chinese medicine group (P<0.05). The results showed that acupuncture group, traditional Chinese medicine group and acupuncture and medicine group could inhibit the expressions of TNF-α, IL-1β and IL-6 protein in spinal cord of CCI rats, especially in acupuncture and medicine group.Conclusion: Electroacupuncture combined with Shentong Zhuyu capsule can significantly improve the latency of heat shock reflex in CCI model rats, and its mechanism may be related to inhibiting the upregulation of proinflammatory cytokines of TNF-α, IL-1β and IL-6 in spinal cord tissue.

Neuropathic pain; Electroacupuncture; Shentong Zhuyu capsule; Proinflammatory cytokines

黑龙江省自然科学基金项目(No.H2015034);黑龙江省博士后基金项目(No.LBH-Z12264);黑龙江中医药大学科研基金项目(No.035143)

金弘(1978-),男,副主任医师,主要从事针刺对各种疼痛性疾病的临床与机理研究工作。

刘婷婷*(1979-),女,副教授,主要从事针灸治疗神经系统疾病的研究工作。

2016-10-20

R246

A

1002-2406(2017)03-0078-05

修回日期:2016-11-10

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