芪桂益脉灵干预急性心肌缺血再灌注大鼠模型炎症因子ICAM-1，VCAM-1和p38MAPK通路的实验研究

2017-06-05赵龙徐京育张超越臧萌

中医药信息 2017年3期

关键词：低剂量心肌通路

赵龙，徐京育，张超越，臧萌

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨 150040；3.佳木斯大学医学院，黑龙江佳木斯 154007)

芪桂益脉灵干预急性心肌缺血再灌注大鼠模型炎症因子ICAM-1，VCAM-1和p38MAPK通路的实验研究

赵龙1，徐京育2，张超越1，臧萌3*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨 150040；3.佳木斯大学医学院，黑龙江佳木斯 154007)

目的:观察芪桂益脉灵(QGYML)对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤模型血管细胞黏附因子-1(VCAM-1)和内皮细胞间黏附分子-1(ICAM-1),p38MAPK通路的影响。方法：50只大鼠随机分为空白组、假手术组、单纯缺血再灌注组、QGYML低剂量组、QGYML高剂量组5组，灌胃1 h后，结扎左冠状动脉前降支，结扎60 min，再灌注180 min，测定VCAM-1、ICAM-1、p38、p-p38蛋白表达。结果：各组p38蛋白表达基本一致，差异无统计学意义(P>0.05)；单纯缺血再灌注组与假手术组比较,VCAM-1、ICAM-1、p-p38蛋白表达升高(P<0.05)，差异有统计学意义；灌药组与单纯缺血再灌注组比较，VCAM-1、ICAM-1、p-p38蛋白表达明显降低(P<0.05)，差异有统计学意义，高剂量组效果更佳。结论：芪桂益脉灵可以下调VCAM-1和ICAM-1在内皮细胞膜上的表达，抑制p38MAPK通路，对急性心肌缺血再灌注损伤有抑制作用。

芪桂益脉灵；细胞间黏附分子-1；血管细胞黏附分子-1；再灌注损伤；p38丝裂原活化蛋白激酶

血运重建的发展和成熟虽能重建冠脉血流供应，但患者反复心绞痛发作、进行性心功能恶化以及患者心肌缺血现象持续存在，说明大血管的血运重建并不代表心脏微循环的改善以及心脏再灌注的成功，不能完全解决微循环障碍所带来的问题，然而微循环在心脏供血过程中发挥着重要的作用，其结构和功能的正常与否也直接关系到心脏的功能和代谢[1-8]。本实验前期研究证实[7-9]，芪桂益脉灵能够减小心肌梗死面积，清除氧自由基的产生，提高心肌抗氧化能力，降低钾离子通道的开放的时间和概率，抑制心肌细胞的凋亡，发挥对缺血再灌注心肌的保护作用。本实验在以往研究的基础上，通过观察芪桂益脉灵对急性心肌缺血再灌注损伤后VCAM-1、ICAM-1以及p38信号通路的影响，进一步探讨其作用机制，为以后的应用提供依据。

1 材料

1.1 实验动物及分组

健康雄性SD大鼠(体质量200～250 g，许可证号：SCXK(黑)2013-004，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供)50只。随机分为5组，即空白组、假手术组、单纯缺血再灌注组、芪桂益脉灵低剂量组、芪桂益脉灵高剂量组，常规饲养1周后用于实验。

1.2 试剂

芪桂益脉灵(党参、黄芪、三七、炒酸枣仁、苦参、龙齿、黄连、桂枝、麦门冬、五味子)(江阴天江药业有限公司)；Sc-101759(兔一抗)试剂盒、Sc-7149(兔一抗)试剂盒、Pv-9001(兔二抗)试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)酶联免疫分析试剂盒(北京诚林生物科技有限公司)。

1.3 实验仪器

电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；DH-150型小动物呼吸机(浙江大学医学仪器厂)；ECG-1150型心电机(上海光电医用电子仪器有限公司)；318型洗板机(上海三科仪器有限公司)；低温冰箱(日本三洋公司)；NiKon E200光学显微镜(日本)；冰冻切片机；DK-8B型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)；ELX808全自动酶标仪(上海启步生物科技有限公司)；低温离心机(日本三洋公司)。

2 方法

大鼠用20%乌拉坦(1 g/kg)进行腹腔麻醉，然后将麻醉后的大鼠固定于手术台上行心电检测，气管切开，连小动物呼吸机，潮气量为12 ml，呼吸频率为90次/min，呼吸比为1∶1。从胸骨左缘3、4肋间处钝性分离皮肤和肌肉，剪开胸骨，轻轻分离心包膜，充分的暴露心脏；在肺动脉圆锥和左心耳的交界处，于浅层心肌下穿过一条丝线，结扎左冠状动脉前降支，两端穿一条聚乙烯塑料管，末端用小动脉夹固定，结扎后将心脏送回胸腔。连续记录冠状动脉前降支结扎前后及再通后心电图。空白组：只开胸，不穿线，不结扎；假手术组：开胸、只穿线但不结扎；单纯缺血再灌注组：末次灌药后1 h行左主冠状动脉结扎60 min，再灌注180 min；芪桂益脉灵高剂量组、芪桂益脉灵低剂量组造模方法与单纯缺血再灌注组相同。

模型成功标准:结扎后心电图S-T段拱背抬高或QRS波增高、增宽与T波融合；松开小动脉夹后,ST段下降1/2以上。

3 实验指标检测

3.1 VCAM-1、ICAM-1检测

造模成功后，开腹暴露腹主动脉，采血5 ml，低温离心后取上层血清按照酶联免疫试剂盒检测步骤测定。

3.2 p38、p-p38检测

实验结束后，立即处死大鼠，摘取心脏，用生理盐水冲洗血渍，浸泡于10%的甲醛中固定备用。

HE染色：取出固定在10%甲醛中的心脏组织，用酒精梯度脱水，石蜡包埋，冰冻切片机切片(厚约5 μm)，HE染色，封片，在光镜下观察(结果见图1)。

免疫组化法检测：具体实验步骤参照文献[5]进行。在400×光镜下拍摄切片图像，每张图片选取3个不重叠视野计算平均阳性百分比。详见图2～3。

3.3 统计学处理

4 实验结果

4.1 VCAM-1和ICAM-1结果比较

表1显示，假手术与空白对照组相比，ICAM-1，VCAM-1含量并无明显差异(P>0.05)；冠脉结扎组与空白组、假手术组相比，ICAM-1、VCAM-1含量有统计学意义(P<0.05)；用药组(QGYML低剂量、QGYML高剂量)与单纯缺血再灌注组相比，ICAM-1，VCAM-1含量均降低，差异有统计学意义(P<0.05),表明QGYML具有抗心肌缺血损伤，保护血管内皮的作用，其中高剂量组效果更佳。

4.2 各组缺血再灌注大鼠心肌组织病理形态学改变

单纯缺血再灌注组，心肌纤维排列紊乱，部分区域有断裂，细胞破坏严重，心肌纤维肿胀明显，细胞间质水肿、增宽，有少量炎症细胞；芪桂益脉灵组与单纯缺血再灌注组相比心肌纤维排列基本整齐，炎症细胞浸润减少，间质肿胀不明显，其中高剂量组改善更为显著。

4.3 p38MAPK免疫组化结果

各组大鼠心肌组织中p38表达比较稳定，无统计学意义(P>0.05)；假手术组与空白组相比，p-p38的蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；冠脉结扎组与空白组对比，p-p38的蛋白表达水平增加显著，差异具有统计学意义(P<0.05)；芪桂益脉灵低剂量组、芪桂益脉灵高剂量组与单纯缺血再灌注组相比，p-p38的表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；芪桂益脉灵高剂量组与芪桂益脉灵低剂量组比较，p-p38蛋白表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见表1。

表1 各组ICAM-1、VCAM-1、p38、p-p38含量比较

注：与空白组比较,#P<0.05;与假手术组比较，△P<0.05;与单纯缺血再灌注组比较，○P<0.05;与芪桂益脉灵低剂量组比较,▽P<0.05。

图1 HE染色组图(400×)

图2 p38组图(400×)

图3 p-p38组图(400×)

5 讨论

目前研究认为，在急性缺血再灌注损伤中，内皮细胞是关键，黏附分子是导致内皮损伤的重要因素，而黏附分子表达的调控，丝裂原活化蛋白激酶信号通路起到了重要的作用[9-11]。黏附分子选择素使白细胞与微血管内内皮形成疏松的结合，之后在炎症因子VCAM-1和ICAM-1的作用下，与微血管内皮结合牢固，同时ICAM-1可引起细胞骨架的改变，有利于炎性细胞向局部组织浸润，损伤微血管内皮细胞，造成心肌细胞的损伤[12-16]。当缺氧等一系列刺激下，使得p38MAPK被磷酸化激活p-p38，促进内皮细胞表达黏附分子VCAM-1、ICAM-1，造成内皮细胞的损伤；此外p38还可以使MAPKAP2磷酸化，激活炎性细胞因子基因TNF-α，TNF-α也可以反向激活p38信号通路，加重炎症反应。由此可见抑制p38信号通路的激活，对保护心肌细胞意义重大[17-18]。

本实验通过观察芪桂益脉灵对急性缺血再灌注损伤大鼠模型p38信号通路和炎性因子VCAM-1及ICAM-1的影响。结果表明芪桂益脉灵能够减轻炎症反应，减轻炎性浸润，抑制p38信号通路的激活，减轻心肌的坏死灶，改善心肌的病理学改变，保护损伤心肌。

芪桂益脉灵是导师徐京育教授临床多年的经验总结，临床颇有效验。该方由桂枝、黄芪、三七、麦门冬、五味子等10余味药物组成，方中桂枝辛、甘、温，能温通经脉,助阳化气，强心；黄芪补气诸药之最，能益气补心，清除自由基，促进机体新陈代谢，扩张血管，促进微循环[19]；三七能够活血、化瘀、定痛，能够抗血小板聚集和溶栓，此外，三七还可以降低心肌的耗氧量，提高氧利用率；麦门冬可养阴清心除烦，提高免疫功能，增加冠脉流量，对于心肌缺血具有明显的保护作用；五味子益气、生津、宁心，能增加机体的免疫功能，降低心肌耗氧。诸药相互配伍，恰中该病的病机，发挥益气活血，化瘀通脉之功效。

实验研究结果显示，急性缺血再灌注损伤后大鼠心肌组织中VCAM-1、ICAM-1和p-p38蛋白表达明显高于空白组和假手术组(P<0.05)，芪桂益脉灵组VCAM-1、ICAM-1和p-p38蛋白表达浓度明显低于模型组(P<0. 05)，其中芪桂益脉灵高剂量组比低剂量组表达浓度更低。实验证实了芪桂益脉灵能通过减轻炎症反应，抑制p38MAPK信号通路，抑制细胞凋亡，达到抗心肌缺血损伤的作用。

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Experimental Study of Qigui Yimailing on ICAM-1,VCAM-1 and p38 Pathway in Rat Models with Acute Myocardial Ischemia-reperfusion Injury

ZHAO Long1,XU Jing-yu2, ZHANG Chao-yue1,ZANG Meng3*

(1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China;2.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China;3.Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

Objective: To study the effect of QGYML on ICAM-1,VCAM-1 and p38 pathway in rat models with acute myocardial ischemia-reperfusion injury.Methods:50 SD male rats were randomly divided into normal group(N),sham operation group(SH),pure ischemia reperfusion group(I/R),QGYML low dose group(QL) and QGYML high dose group(QH). Fill the stomach after one hour; ligate the left anterior descending artery for 60 minutes with 180 minutes of reperfusion; determine VCAM 1, ICAM - 1, p38 and p-p38 protein expressions.Results:There was no statistically significant difference of p38(P>0.05). I/R group was compared with SH group and VCAM-1,ICAM-1 and p-p38 expressions were increased.Compared with I/Q,in QGYML group VCAM-1,ICAM-1 and p-p38 were decreased significantly(P<0.05),and the effect of QH was better.Conclusion:QGYML can cut VCAM-1 and ICAM-1 in endothelial cell membranes, inhibit p38MAPK pathway and inhibit acute myocardial ischemia-reperfusion injury.

Qigui Yimailing;ICAM-1;VCAM-1;Reperfusion injury;p38MAPK