不同产地意大利牛舌草中芦丁和山奈酚的含量测定及其抗补体活性研究

何媛媛，韩红园，李二文，代一航，索亚然，林瑞超

(北京中医药大学中药学院中药品质评价北京市重点实验室，北京 100102)

不同产地意大利牛舌草中芦丁和山奈酚的含量测定及其抗补体活性研究

何媛媛，韩红园，李二文，代一航，索亚然，林瑞超*

(北京中医药大学中药学院中药品质评价北京市重点实验室，北京 100102)

目的：测定不同产地意大利牛舌草中芦丁和山奈酚的含量和其抗补体活性研究。方法：采用UPLC法，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)；流动相为甲醇(A)- 0.4%甲酸(B)；洗脱程序(0～3 min, 5%～31% A； 3～10 min, 31%～37% A；10～12 min, 37%～40% A；12～30 min, 40%～40% A)，柱温30℃；检测波长366 nm。通过溶血试验评价芦丁和山奈酚的抗补体活性。结果：意大利牛舌草中芦丁和山奈酚的含量分别在1.25-3.34 mg/g和2.86-6.05 mg/g范围内，且芦丁和山奈酚均具有较好的抗补体活性。结论：意大利牛舌草中2种主要活性成分的含量同地区之间差异较小，不同地区之间存在差异，且这两种成分均具有较好的抗补体活性。

意大利牛舌草；含量测定；芦丁；山奈酚；抗补体活性

意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)为紫草科牛舌草属多年生草本植物地上部分，维文名为高孜万，主要分布于地中海和热带地区[1-2]，主要功效具有生湿生热、调节异常黑胆质、生湿补脑、祛寒补心、爽心悦志、润燥消炎、止咳平喘等作用。现代研究表明，意大利牛舌草具有抗肿瘤[3-4]、抗氧化[5-6]、抗菌[7]等生物活性，临床上主要用于治疗干寒性或黑胆质性疾病，如平性脑虚、心悸、抑郁症、干性脑膜炎、高血压、肺炎及结核疾病、寒性咳嗽、感冒、气喘等[8]。意大利牛舌草中主要化学成分有黄酮类、脂肪酸类、三萜类和挥发油类，其中黄酮类含量较高[9]。各种药效成分的含量和活性对其药效具有显著影响。目前，各个产地的意大利牛舌草活性成分的含量是否存在差别，以及其主要代表性化合物芦丁和山奈酚的抗补体活性都没有相关报道。因此，本实验采用UPLC法对不同产地意大利牛舌草中的代表性化合物芦丁和山奈酚进行含量测定，并对芦丁和山奈酚进行抗补体活性研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

RJ-LD-IIB型低速大容量多管离心机(无锡市瑞江分析仪器有限公司)；低温高速离心机(Sigma公司)；EPOCH型酶标仪(Bio Tek，美国)；Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱仪(Waters公司)；BP 211D 型1 /10 万电子天平(Sartorious 公司)；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；KQ-500型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料

豚鼠(体质量250～300 g，北京华阜康生物科技股份有限公司)；无菌抗凝绵羊血(北京索莱宝科技有限公司，批号20160525)；抗SRBC抗体(溶血素,北京索莱宝科技有限公司，批号20160429)。

6批意大利牛舌草药材(表1)购自新疆麦迪森维药有限公司，经北京中医药大学林瑞超教授鉴定为紫草科牛舌草属植物意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)的干燥全草。

芦丁(批号PS160113-02)和山奈酚(批号PS0207-0020)对照品均购自成都普思生物科技有限公司;甲醇：色谱醇(Fisher公司，美国);其他均为分析纯试剂;水为屈臣氏蒸馏水。

表1 实验用意大利牛舌草药材的来源

2 方法与结果

2.1 两种成分的含量测定

2.1.1 液相色谱条件及系统适用性实验

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)；柱温：30℃;流动相：甲醇(A)- 0.4%甲酸(B)。洗脱程序(0～3 min，5～31% A；3～10 min，31%～37% A；10～12 min，37%～40% A；12～30 min，40%～40% A);进样量：2 μL；检测波长366 nm。采用上述条件分别得到对照品和意大利牛舌草药材的色谱图，如图1所示。样品中芦丁和山奈酚的保留时间分别为11.475 min和22.268 min，其色谱峰与相邻色谱峰达到基线分离。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取芦丁和山奈酚对照品适量，分别置于10 mL容量瓶中。然后加入适量甲醇制成芦丁和山奈酚浓度分别为0.030 3 mg/mL和0.010 0 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

取本品粗粉(粉碎，过40目筛)，精密称定1.000 0 g，置250 mL圆底烧瓶中，加甲醇40 mL、25% HCl溶液10 mL，85℃回流提取1.5 h，过滤，定容于10 mL容量瓶中，摇匀，用0. 22 μm的微孔滤膜滤过，即得[10]。

图1 芦丁对照品(A)、山奈酚对照品(B)和意大利牛舌草样品(C)UPLC图注：1：芦丁；2：山奈酚。

2.1.4 标准曲线的制备

分别取芦丁和山奈酚对照品溶液各100 μL，用甲醇倍比稀释得到0、2、4、8、16、32倍稀释的6份标准溶液。分别进样2 μL，按上述色谱条件测定，以峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标进行线性回归。得回归方程芦丁：Y=1×107X+1 250(r=0.999 4)；山奈酚：Y=2×108X-2 125(r=0.999 8)。结果表明，芦丁和山奈酚分别在0.947～15.2 μg/mL和0.313～10.0 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验

取同一意大利牛舌草样品供试品溶液，连续进样6次，进样量均为2 μL。测定芦丁和山奈酚的峰面积，计算芦丁和山奈酚的RSD分别为 0.33%和0.34%，结果表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验

取同一批意大利牛舌草供试品，分别在0、2、4、8、10、12、24 h进样2 μL。分别根据峰面积考察样品的稳定性，计算得到芦丁和山奈酚的RSD分别为0.76%和1.92%，结果表明供试品至少在24 h内稳定。

2.1.7 重复性试验

精密称取同一批意大利牛舌草供试品6份，按“2.1.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，分别进样2 μL测定。结果显示，芦丁和山奈酚的RSD分别为1.20%和1.74%，结果表明该方法重复性良好。

2.1.8 定量限和检测限试验

取上述各对照品溶液，逐步稀释进样，直至S/N=3和S/N=10，此时的进样量即分别为检测限(LOD)和定量限(LOQ)。测定得芦丁和山奈酚的检测限分别为0. 32 ng和0.20 ng；定量限分别为1.05 ng和0.71 ng。

2.1.9 加样回收率试验

精密称取同一批供试品6份，每份1.000 0 g，分别定量加入两种对照品，测定样品中相应的化合物的含量，计算加样回收率，结果见表2。

2.1.10 意大利牛舌草中两种成分的含量测定

取购自不同产地6批意大利牛舌草药材，每批3份，按上述方法测定其中芦丁和山奈酚的含量，计算平均值，结果见表3。

2.2 补体经典途径的溶血活性(CH50)测定[11]

2.2.1 溶液配制

巴比妥缓冲盐(BBS)，包含0.5 mol/L镁(Mg2+)和0.15 mol/L钙(Ca2+)。取溶血素适量，加入BBS,配制成为1∶1 000溶血素溶液。

表2 意大利牛舌草中两种成分的加样回收率测定结果

表3 6批意大利牛舌草药材中两种成分的含量

2.2.2 补体的效价测评定

取补体(豚鼠血清)0.1 mL，加入BBS配制成1∶5溶液，用BBS对倍稀释成1∶10，1∶20，1∶40，1∶80,1∶160，1∶320，1∶640。取1∶1 000溶血素、各浓度补体及2% SRBC各0.1 mL溶于0.3 mL BBS中，混匀，37℃水浴温育30 min后放入低温高速离心机，在5 000 rpm、4℃条件下离心10 min。分别取每管上清0.2 mL于96孔板，在405 nm处测定吸光度。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准(0.1 mL 2% SRBC溶于0.5 mL三蒸水中)，选择达到相似吸光度的最低补体溶液作为正常溶血所需要的临界补体浓度。

2.2.3 药物经典途径抗补体活性测定

取临界浓度的补体分别与不同浓度的供试品混匀，加入适量的BBS、溶血素和2% SRBC。37℃水浴温育30 min，离心后取上清液在405 nm处测定吸光度。实验同时设置中药对照组(将等量的供试品加入BBS缓冲液中，用于测定中药本底A值)、补体组(取临界质量浓度的补体加入BBS缓冲盐、2% SRBC，用于测定临界质量浓度补体所造成红细胞溶血的A值)和全溶血组(将2% SRBC加入水中使之全溶血，用于观察补体组是否达到或接近全溶血水平)。计算溶血抑制率。

溶血抑制率=1-(A中药组-A中药对照组)/A补体组

2.3 芦丁和山奈酚抗补体活性测定结果

本实验测定了芦丁和山奈酚的体外抗补体活性，虽然均小于阳性药肝素钠(0.048 ± 0.012)mg/mL，但对经典途径的补体激活都有一定的抑制作用，结果见表4。

表4 芦丁和山奈酚抗补体活性测定结果

3 结论

本研究建立了同时测定意大利牛舌草中芦丁和山奈酚UPLC含量的方法。通过方法学考察证明，该方法精密度、重复性、稳定性良好。采用该方法成功地测定了来自巴基斯坦、四川、新疆等地6批意大利牛舌草药材中两种成分的含量。

意大利牛舌草中两种主要活性成分的含量同地区之间差异较小，不同地区之间存在差异，提示其质量也可能存在差异。因此，为了更好的控制意大利牛舌草的质量，需要进行不同产地的生存条件与活性成分含量以及药效学的相关性研究。

本实验对意大利牛舌草的2个黄酮类成分芦丁和山奈酚进行了抗补体活性评价，发现芦丁和山奈酚均具有较好的抗补体活性，且山奈酚的抗补体活性强于芦丁，表明芦丁和山奈酚是意大利牛舌草抗补体活性的主要药效组分。

[1] Ketabchi S, Moatari A, Shadram M,et al. The anti influenza virus activity of Anchusa italic[J]. Asian J Exp Biol Sci,2011,2(4):558-561.

[2] Abbas M, Disi A, Al-Khalil S. Isolation and identification of anti-ulcer components from Anchusa strigosa root [J]. Jordan Journal of Pharmaceutical Sciences, 2009,2(2):131-139.

[3] Sahranavard S,Naghibi1 F,Mosaddegh M,et al. Cytotoxic activities of selected medicinal plants from Iran and phytochemical evaluation of the most potent extract [J]. Research in Pharmaceutical Sciences,2009,4(2):133-137.

[4] 木拉提·克扎衣别克,Brigitte K,Sonja P,等.异常黑胆质成熟剂中各单味药对HL-60细胞增殖的抑制作用[J].科技导报,2009,27(19):94-98．

[5] Kuruuzum A, Guvenalp Z, Kazaz C, et al. Four new triterpenes from Anchusa azurea var. Azurea[J].Helvetica Chimica Acta,2010,93(3):457-465.

[6] 谢周建,戴沩,黎梅,等.维药牛舌草活性部位的抗氧化和美白作用[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(12):150-152.

[7] Susan A, Rosfarizan M, Azadeh B, et al. Effect of annealing temperature on antimicrobial and structural properties of bio-synthesized zinc oxide nanoparticles using flower extract of Anchusa italica[J].Journal of Photochemical and Photobiology Biology,2016,161: 441-449.

[8] 阿布热依木·卡地尔．中华本草·维吾尔药分卷[M].上海:上海科学技术出版社,2005:99.

[9] 木合塔尔·奴尔买买提,杨武亮,吐尔洪·艾买尔,等.维吾尔药牛舌草中总黄酮提取工艺的研究[J].时珍国医国药,2008,19(6):1303-1304.

[10] 李晓娟,薛培凤,鞠爱华,等.蒙药玉簪花中山奈酚的HPLC含量测定与薄层色谱鉴别[J].内蒙古医学院学报,2011,33(4):307-310.

[11] Xu H,Zhang YY,zhang JW,et al. Isolation and characterization of an anti-complementary polysaccharide D3-S1 from the roots of Bupleurum smithii [J]. Int Immunopharmacol,2007,7:175.

Content Determination of Rutin and Kaempferol inAnchusaItalicaRetz.from Different Regions and Its Anti-complement Activity

HE Yuan-yuan, HAN Hong-yuan, LI Er-wen, DAI Yi-hang, SUO Ya-ran, LIN Rui-chao*

(Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Quality Evaluation, School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

Objective: To determine the content of rutin and kaempferol inAnchusaitalicaRetz. from different regions and its anti-complement activity. Methods: UPLC was used, and the analysis was performed on a ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)with methanol (A) - 0.4% formic acid solution (B) as the mobile phases with gradient elution (0-3 min, 5-31% A; 3-10 min, 31%-37% A; 10-12 min, 37%-40% A; 12-30 min, 40%-40% A). The column temperature was set at 30℃, and the UV detection wavelength was 366 nm. Anti-complement activity of rutin and kaempferol was evaluated by hemolysis test. Results: The contents of rutin and kaempferol in Anchusa italica Retz were in the range of 1.25-3.34 mg/g and 2.86-6.05 mg/g, respectively. Rutin and kaempferol had a good anti-complement activity. Conclusion: There is no significant difference in the contents of two components in Anchusa italica Retz from the same region, but has differences in different regions. The two components have a good anti-complement activity.

AnchusaitalicaRetz.; Content determination; Rutin; Kaempferol; Anti-complement activity

国家中医药管理局公益性行业科研专项项目(No.201507004)

何媛媛(1990-)，女，北京中医药大学2014级民族药学专业硕士研究生，主要研究方向：民族药药效与化学成分研究。

林瑞超*(1954-)，男，教授，博士研究生导师，主要研究方向：中药与民族药的品质评价研究。

2016-11-01

R284

A

1002-2406(2017)03-0020-04

修回日期：2016-11-30