苏木乙酸乙酯提取物对动脉粥样硬化模型大鼠血脂及MMP-9的影响

2017-06-05杨建飞魏来张婧懿

中医药信息 2017年3期

关键词：苏木辛伐他汀乙酸乙酯

杨建飞，魏来，张婧懿*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨 150040)

苏木乙酸乙酯提取物对动脉粥样硬化模型大鼠血脂及MMP-9的影响

杨建飞1，魏来2，张婧懿1*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨 150040)

目的：应用苏木乙酸乙酯提取物对动脉粥样硬化(AS)大鼠模型进行干预，测定大鼠血脂及血清基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的水平，进而为苏木乙酸乙酯提取物抗AS化作用提供客观依据。方法:采用腹腔注射维生素D3建立AS模型。将SD大鼠随机分为空白组、模型组、苏木低、中、高剂量组、辛伐他汀组，苏木低、中、高剂量组分别给予苏木乙酸乙酯提取物溶液10 ml/(kg·d)灌胃，分别相当于生药量1.15 g/(kg·d)、2.30 g/(kg·d)、3.45 g/(kg·d)；辛伐他汀组灌服辛伐他汀溶液4.20 g/(kg·d)，空白组与模型组灌服等体积的羧甲基纤维素钠溶液。4周后取各组大鼠胸主动脉及腹主动脉采血，取得血清，测定血脂水平，应用ELISA法检测各组大鼠血清MMP-9的水平。结果：与空白组相比，模型组的TG、LDL-C、MMP-9水平升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与辛伐他汀组相比，苏木高、中、低剂量组TG、LDL-C、MMP-9表达水平无明显差异(P>0.05)；与模型组相比，苏木高、中、低剂量组和辛伐他汀组的TG、LDL-C、MMP-9水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：苏木乙酸乙酯提取物能够降低AS模型大鼠血脂及MMP-9的表达水平，其作用与辛伐他汀相当。

动脉粥样硬化；甘油三酯；低密度脂蛋白胆固醇；苏木；基质金属蛋白酶-9

随着人们生活水平的不断改善，心脑血管疾病的患病率在逐年增长，并且严重威胁人类健康以及生活质量，而其真正的幕后推手正是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)。其致病原因尚未完全明确，但是细胞外基质的降解、脂质浸润、血流动力学的改变等多种原因在其形成和发展过程中起到了重要的作用。已有研究表明，炎症反应贯穿AS始终，且发挥着不可替代的重要作用，其中基质金属蛋白酶组(Matrix Metalloproteinases，MMPs)在降解和重构细胞外基质过程中起决定性作用，导致斑块稳定性遭到破坏，因而加速了AS进程，而在MMPs中占重要地位的MMP-9应得到足够的重视，其参与了细胞外基质降解以及重构的全过程，在AS的斑块形成、血管重构、斑块稳定性失衡、斑块破裂过程中其表达过度和活性增强，是心血管事件中较为重要的的预测因子之一[1-2]。目前经研究证实部分活血化瘀类中药单体及复方能在不同程度上降低AS动物模型的血脂水平，对内皮细胞结构和功能具有保护作用。而中药苏木作为活血化瘀药应用于临床已有数千年的历史，近年来更发现其还具有免疫抑制、抗肿瘤、抗炎及抗氧化等药理作用[3-8]。因此我们再此基础上提出假说，苏木乙酸乙酯提取物作为苏木的有效部位，可通过调节血脂，调整内皮功能，发挥其抗炎免疫作用从而抑制动脉粥样硬化的进展。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级近交系SD大鼠55只，成年雄性，体质量200～250 g，选取通风、温度、湿度都比较适宜的动物室内饲养。实验动物购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号:SCXK(京)2015-0001。

1.2 苏木乙酸乙酯提取物的制备

苏木，产地云南，购自黑龙江省药材公司，经生药鉴定制成苏木粗粉(40目)。用乙醇浸泡，加热，回流，过滤，将合并后的滤液水浴蒸干，烘干制成乙醇提取干粉。使用双蒸水混悬乙醇提取干粉，之后用乙酸乙酯萃取，回收溶剂得到乙酸乙酯提取物。

1.3 实验药物

辛伐他汀片(杭州默沙东制药有限公司)；维生素D3(江苏吴中医药集团有限公司)；乌拉坦(上海浩然生物技术有限责任公司)；福尔马林(江苏凯茂石化科技有限公司)；羧甲基纤维素钠(河北石家庄森隆化工有限公司)；ELISA试剂盒(上海康郎生物技术有限公司)。

辛伐他汀片溶于羧甲基纤维素钠10 ml中，稀释成浓度为0.42 mg/ml的悬浊液；苏木乙酸乙酯提取物溶于羧甲基纤维素钠10 ml中，配制成浓度为0.115 g/ml的苏木乙酸乙酯提取物悬浊液，室温留存备用。

1.4 AS模型的建立

大鼠腹腔内注射维生素D370万IU/(kg·d)，连续3天。之后饲喂高脂饲料(配方为0.5%胆酸钠、3%胆固醇、5%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶、91.3%普通饲料)12周，造模大鼠分笼饲养，饮用洁净水。

1.5 实验分组及给药

实验大鼠适应性喂养1周之后随机分为6组(空白组、模型组、苏木乙酸乙酯低剂量组、苏木乙酸乙酯中剂量组、苏木乙酸乙酯高剂量组、辛伐他汀组)，每组8只。空白组给予普通饲料喂养(配方为麸皮24.5%、鱼粉6%、豆饼12%、玉米24.5%、大麦21%、其他辅料12%)，其余组大鼠应用上述方法复制AS模型。苏木乙酸乙酯低、中、高剂量组分别按1.15 g/(kg·d)、2.30 g/(kg·d)、3.45 g/(kg·d)给予苏木乙酸乙酯提取物溶液灌胃;辛伐他汀组的剂量按体表面积等效剂量比换算，灌服4.2 mg/(kg·d)；空白组及模型组灌服等体积羧甲基纤维素钠10 ml/(kg·d)。

1.6 标本取材

造模12周后处死3只大鼠，应用电子显微镜观察腹主动脉血管壁是否有AS的血管内皮损伤形成。待给药28天后，进行腹主动脉采血，离心，取血清，-20℃冰箱内冷藏，进行血脂检测及ELISA法检测；采集腹主动脉，纵行剪开，固定、包埋、切片，进行HE染色。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 病理形态学观察

在电镜下观察，腹主动脉血管壁呈AS内皮损伤改变，提示造模成功。本次研究发现模型组、辛伐他汀组、苏木组血管内皮发生病理性改变，经给予药物干预后苏木组及辛伐他汀组病理改变较模型组减轻，而辛伐他汀组与苏木组病理改变程度相当。结果见图1。

图1 各组大鼠病理形态学结果(HE染色)

2.2 血脂检测比较

结果显示：高脂饲料饲养下的模型组血清中的TG、LDL-C水平升高，与正常饲料饲养下的空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)；苏木低剂、中、高剂量组、辛伐他汀组血清中的TG、LDL-C水平降低，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与辛伐他汀组比较，苏木高、中、低剂量组血清TG、LDL-C的水平无差异(P>0.05)。见表1。

2.3 大鼠血清MMP-9含量测定

实验结果表明，模型组、辛伐他汀组、苏木低、中、高剂量组MMP-9水平升高，与空白组比较有显著性差异(P<0.05)；与模型组比较，苏木低、中、高剂量组及辛伐他汀组血清MMP-9的水平降低，与空白组比较有显著性差异(P<0.05)；与辛伐他汀组比较，苏木低、中、高剂量组MMP-9水平无显著性差异(P>0.05)。

表1 各组大鼠血脂检测结果

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与辛伐他汀组比较，▲P>0.05。

表2 各组大鼠血清MMP-9水平的变化

注:与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与辛伐他汀组比较，▲P>0.05。

3 讨论

据《中国心血管病报告2013》的报道显示，目前全国心血管病的患者高达2.9亿人，也就是说平均每5人中有1人患心血管病。而心血管疾病的始动环节即为动脉粥样硬化，多数学者认为其与脂质代谢异常关系最为密切，是急性冠脉综合征及脑卒中等心脑血管事件的主要病理基础。寻找和探索有关AS的治疗新策略对于降低心血管疾病的死亡率意义重大。血脂代谢异常是AS发生发展最重要且与之关系最紧密的因素之一，经生化学证实其沉积于动脉内膜的脂质成分以游离胆固醇和胆固醇酯为主，其中LDL被确定为AS的独立危险因素之一。有研究表明[9-11]，许多具有活血祛瘀活性的中药均可对血脂代谢产生影响，通过改善血脂代谢，降低TG、LDL-C水平产生抗AS的作用。关于AS形成的明确病因尚未确定，除脂质浸润学说外，血流动力学说、炎症反应学说、内皮损伤反应学说等多种学说存在已久，炎症反应学说目前被人们普遍关注，认为AS的进程就是炎症反应的过程[12]。炎症反应在AS形成、发展及演变过程中起重要作用，血清MMP-9是反映机体炎症反应比较敏感的指标，细胞外基质是血管壁的重要组成部分，其降解和重塑过程参与了AS的形成与发展的全过程，而参与降解的炎症因子主要是MMPs，临床上细胞外基质的过度降解使AS斑块易于破裂出血引起急性冠脉综合征的发生等情况[13]。解冰川等[14]认为,导致心、脑血管疾病发生率增加的重要危险因素是AS斑块形成及破裂出血，MMP-9始终存在并长期作用，MMP-9对细胞外基质的降解和重塑均有重要意义，在出血性脑卒中及缺血性脑卒中的生理、病理变化过程中均起着重要作用，对于前者来说MMP-9可使血脑屏障遭到破坏，使脑水肿加重从而加重脑损害。所以对AS的抗炎治疗包括抑制MMP-9的活性，可能是防治心脑血管疾病的新的突破口。

实验结果表明，给予高、中、低剂量苏木乙酸乙酯提取物或辛伐他汀治疗可不同程度降低AS模型大鼠血清MMP-9水平，同时能调节血脂。所以我们可以得出结论:苏木乙酸乙酯提取物能够降低动脉粥样硬化模型大鼠TG、LDL-C及MMP-9的水平，可能是其抗动脉粥样硬化作用的原因之一。

[1] 朱平先.相关炎症因子与动脉粥样硬化[J].中国动脉硬化杂志,2011,19(3):283.

[2] 王莹,康维强,宋达琳.金属蛋白酶对动脉粥样硬化性重构的作用[J].中华临床医师杂志(电子版),2013,21(7):9687-9690.

[3] 潘英明,梁英,黄志清,等.苏木、紫草等五种中草药抗氧化活性的研究[J].天然产物研究与开发,2004,16(1):43-44.

[4] 刘志平,张晶,陈会君.苏木乙酸乙酯提取物对慢性病毒性心肌炎模型小鼠T细胞亚群的影响[J].中医药信息,2015,32(2):22-24.

[5] 翟文姬,代洪绪,陈会君.苏木乙酸乙酯提取物对急性病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡和相关Bcl-2、Bax蛋白表达的影响[J].中医药信息,2016,33(6):1-4.

[6] 杨建飞,张婧懿.苏木乙酸乙酯提取物对大鼠慢性排斥移植心脏心肌生长因子含量的影响[J].中医药学报,2016,44(4):14-17.

[7] 杨建飞,魏来,周晓,周亚滨.苏木提取物对内皮细胞活性的影响[J].中医药学报,2015,43(4):67-69.

[8] 运锋,田源,陈会君.苏木乙酸乙酯提取物对急性病毒性心肌炎小鼠模型心肌组织IFN-γ的影响[J].中医药学报,2016,44(6):27-30.

[9] 谢海波,莫新民,罗尧岳.活血药、破血药对动脉粥样硬化大鼠血液、血液流变学的影响[J].湖南中医药大学学报,2010,30(3):20-22.

[10] 李晋生,陈霞,靳冉,等.活血化瘀中药干预兔动脉粥样硬化形成作用研究[J].中国中医药信息杂志,2012,19(4):35-37.

[11] 曾淑惠.活络效灵丹对高脂饮食致兔动脉粥样硬化实验研究[D].北京：北京中医药大学,2012.