超高效液相色谱－串联质谱法同时测定动物类药材中4种雌激素残留

周文杰，张治军，马娜妹

（1.广西壮族自治区桂林食品药品检验所，广西 桂林 541002； 2.桂林医学院，广西 桂林 541004）

·检验检测·

超高效液相色谱－串联质谱法同时测定动物类药材中4种雌激素残留

周文杰1，张治军1，马娜妹2

（1.广西壮族自治区桂林食品药品检验所，广西 桂林 541002； 2.桂林医学院，广西 桂林 541004）

目的 建立同时测定动物类药材中4种雌激素（雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚和己二烯雌酚）残留的超高效液相色谱－串联质谱（UPLC－MS／MS）法。方法 样品加β－葡萄糖醛酸酶酶解后，甲醇－乙酸钠缓冲盐提取，用Carb小柱和NH2小柱净化。色谱柱为Agilent SB－C18柱（150mm×2.1mm，1.8μm），流动相为乙腈－水，梯度洗脱，柱温为35℃。以负离子多反应监测（MRM）模式监测，同位素内标法定量。结果 4种雌激素质量浓度在1～200 ng／mL的范围内均与峰面积线性关系良好，相关系数r均大于0.998 5，方法检测限均为1.5μg／kg，平均回收率均为70% ～110%，相对标准偏差（RSD）为4.2% ～15.1%。结论 该法灵敏度高、重复性好，可用于动物药材中4种雌激素药物残留的测定。

超高效液相色谱－串联质谱；雌酮；己烯雌酚；己烷雌酚；己二烯雌酚；残留测定；动物类药材

在我国，动物类药材应用历史悠久，在中药发展中有重要地位。随着科技的进步，不少药用动物由野生变为人工养殖。这对于扩大药用动物资源，保护野生濒危动物的品种及资源具有重要作用。在动物的人工养殖过程中，普遍存在兽药使用的问题。例如雌激素，这类药物在动物养殖过程中常作为生长调节剂使用，其性质一般较稳定，不易被降解，通过食物链进入人体后，仍具有较强的生物活性及潜在的致癌性[1]。因此，我国农业部235号公告规定，禁止在动物性食品中检出己烯雌酚。目前雌激素类物质的测定方法有液相色谱法[2]、气相色谱 －质谱法[3－4]、液相色谱 －质谱法[1，5－7]，但测定的样品主要以动物源性食品、饲料、奶粉为主。动物类药材中雌激素测定尚未见研究报道。本试验中以常用动物药鸡内金、土鳖虫、地龙、水蛭为例，建立了同时测定雌酮、己二烯雌酚、己烷雌酚、己烯雌酚残留的超高效液相色谱－串联质谱(UPLC－MS／MS)法。试验结果表明，该法可为检测动物类药材中雌激素药物残留提供技术参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290型Infinity超高效液相色谱仪，Agilent 6460型三重四极杆质谱仪，带喷射流离子聚焦电喷雾离子源（Jet－Stream ESI）(安捷伦科技有限公司)；Mettler XS205DU型电子分析天平(梅特勒中国有限公司)；Millipore synergy型超纯水仪(密理博中国有限公司)；Sigma 3－30K型高速冷冻离心机(德国Sigma有限公司)。

1.2 试药

对照品：雌酮（批号为 100849－200501，纯度为100.0%），购于中国食品药品检定研究院；己二烯雌酚（批号为 30824，纯度为 96.1%），己烷雌酚 （批号为40903，纯度为99.8%），己烯雌酚（批号为31017，纯度为99.5%），均购于Dr.EhrenstorferGmbH公司；雌酮－d2（批号为C330P14，纯度为99.1%），己烯雌酚－d8（批号为I415P17，纯度为99.6%），均购于C／N／D ISOTOPES公司；己二烯雌酚－d2（批号为227，纯度为100.0%），购于CEC公司；己烷雌酚－d4（批号为H295303，纯度为97.0%），购于TRC公司；β－葡萄糖醛酸酶／芳基硫酸酯酶溶液（β－葡萄糖醛酸酶≥100 000 U／m L，芳基硫酸酯酶≤20 000 U／m L，批号为W 291K121），购于上海安谱科技有限公司。

样品：地龙、水蛭、鸡内金、土鳖虫各30批，购自不同地区药材市场和药店。

试剂：甲醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷均为色谱纯，乙酸、乙酸钠为分析纯；水为超纯水（电阻率为18.2MΩ／cm）。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent SB－C18柱（150 mm×2.1mm，1.8μm）；流动相：乙腈和水梯度洗脱(0～1 min，35%乙腈线性变化至 55%；1～5 min，55%乙腈线性变化至65%；5～8 min，维持 35%乙腈)；柱温：35℃；流速：0.2m L／min；进样量：10μL。

2.1.2 质谱条件

采用带Jet－Stream的电喷雾离子源（ESI）；干燥气温度：350℃；干燥气流量：5 L／min；鞘气温度：250℃；鞘气流量：11 L／min；选择负离子扫描方式，毛细管电压为3 500 V；多反应检测模式（MRM）；定量离子对、定性离子对、碎裂电压、碰撞能量见表1。

表1 质谱分析条件

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品贮备液

取雌酮、己二烯雌酚、己烷雌酚和己烯雌酚对照品各10 mg，置10 m L容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，分别得到质量浓度为1 000μg／m L的对照品贮备液。

2.2.2 内标溶液

取雌酮－d2、己二烯雌酚－d2、己烷雌酚－d4、己烯雌酚－d8对照品溶液1 m L，用乙腈溶解并稀释成质量浓度为100 ng／mL的内标溶液。

2.2.3 供试品溶液

称取粉碎后的样品2.0 g置50m L离心管中，加入内标溶液100μL，加入10 m L乙酸－乙酸钠缓冲溶液[称取43.0 g乙酸钠（NaAC·4H2O），加入22m L乙酸，用水溶解并稀释至1 000m L，用乙酸调节pH至5.2]，涡旋混匀 1 min，加入 β－葡萄糖醛酸酶 100μL，于（37±1）℃震荡酶解12 h，取出冷却至室温。加入20mL甲醇超声提取30min，4℃以下10000 r／min离心10min，吸取上清液3m L置另一洁净烧杯中，加水10mL，混匀后待净化。

Carb小柱（500mg，6 m L）依次用6 mL二氯甲烷－甲醇溶液（7∶3，V／V）、6m L甲醇、6mL水活化；NH2小柱（500 mg，6 m L）用6 m L二氯甲烷－甲醇溶液（7∶3）活化。将待净化液以2 m L／min的速度上样于Carb小柱，将小柱减压抽干，再将活化好的NH2小柱串接在Carb小柱下方，用6m L二氯甲烷－甲醇溶液（7∶3，V／V）洗脱并收集洗脱液，取下Carb小柱，再用2mL二氯甲烷－甲醇溶液（7∶3，V／V）洗脱，合并洗脱液，于35℃水浴中氮吹至干，残渣加50%乙腈1 mL溶解，涡旋振荡30 s，过0.2μm滤膜置进样瓶，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验

按2.1项下色谱及质谱条件试验，在空白基质加对照品溶液的多反应监测（MRM）质谱图中，在雌酮、己二烯雌酚、己烷雌酚和己烯雌酚峰附近未见有明显的杂质干扰峰。详见图1。

2.3.2 标准曲线绘制

取混合对照品贮备液与内标贮备液适量，用乙腈稀释成质量浓度分别为1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0 ng／mL的混合对照品溶液。每份均含有10.0 ng／m L内标溶液，按拟订色谱、质谱条件测定。以对照品与内标的峰面积比（Y）为纵坐标、对照品与内标的质量浓度比（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程，雌酮为 Y＝0.240 146X＋0.006 858，r＝0.999 5 (n＝8)；己二烯雌酚为 Y＝0.181 206X＋0.064 213，r＝0.998 5(n＝8)；己烷雌酚为 Y＝0.325 09X－0.037734，r＝0.9993(n＝8)；己烯雌酚为 Y＝0.164558X－0.035 598，r＝0.999 2(n＝8)。结果表明，4种雌激素质量浓度在1～200 ng／m L范围内与峰面积线性关系良好。

图1 4种雌激素及内标的MRM色谱图

2.3.3 精密度试验

取质量浓度为20 ng／mL的混合对照品溶液10μL，连续进样 5次，按拟订色谱、质谱条件测定，记录峰面积。结果雌酮、己二烯雌酚、己烷雌酚和己烯雌酚峰面积的 RSD分别为2.0%，2.0%，2.4%，2.7%(n＝5)，表明仪器精密度较好。

2.3.4 定量限及检出限测定

取空白土鳖虫样品2.0 g，置50mL离心管中，添加50 ng／m L的对照品溶液0.2 mL，放置一段时间，即添加量为5μg／kg，依法提取和净化，按拟订色谱、质谱条件进样，测定。依据特征离子色谱峰信噪比 S／N＝3确定方法检出限，S／N＝10确定方法定量限。结果测得雌酮、己二烯雌酚、己烷雌酚、己烯雌酚的检出限均为1.5μg／kg，定量限均为5μg／kg。

2.3.5 回收率试验

称取空白土鳖虫样品2.0 g，置50 m L离心管中，分别添加 200 ng／mL的混合对照品溶液 0.25，0.5，1.0 m L（即添加量为 25，50，100μg／kg），放置一段时间，依法提取和净化，按拟订色谱、质谱条件进样测定，每个质量浓度作6次平行试验，计算3种浓度下的回收率和方法精密度。结果见表2。

表2 雌酮、己二烯雌酚、己烷雌酚和己烯雌酚的回收率试验结果(n＝6)

2.4 样品含量测定

从医药公司及药店购买鸡内金、土鳖虫、地龙、水蛭药材饮片各10批样品进行测定，结果均未检出4种雌激素。

3 讨论

3.1 提取方法的比较

在质谱检测过程中，样品的基质效应是不能忽视的问题。样品的制备方法通常包括提取与净化2个步骤。参考相关文献，采用提取后添加法[8]分别比较了以下几种方法的基质效应：1）碳酸钠溶液（100 g／L）＋乙酸乙酯提取，HLB小柱净化[1]；2）国标21981－2008中样品制备方法[5]；3）纯水＋乙腈＋NaCl提取，NH2小柱净化[6]；4）乙腈提取，C18小柱净化[7]。结果1)，3)，4)3种方法制备的样品溶液基质效应很明显，估计是因为动物药材含水量少，基体组成复杂，在样品制备过程中提出的干扰基质多，净化的效果不理想。而按国标方法制备的样品溶液可检测到相应的对照品色谱峰，但仍存在一定的基质效应。将提取液减量进行净化，样品的基质效应基本可以消除，同时可获得较好的回收率及灵敏度。因此，样品的制备参照国标方法进行，同时将提取液减量净化。

3.2 色谱和质谱条件的优化

以目标化合物的灵敏度与分离度为考察指标，分别比较乙腈－0.1%乙酸、乙腈－水、乙腈－10mmol／L乙酸铵（含0.1%甲酸）为流动相的效果，结果通过调整洗脱梯度，3种流动相对4种组分的分离效果相当。而以乙腈－水为流动相时，各组分可获得最大的灵敏度，因此确定以乙腈－水为流动相，梯度洗脱。

配制10μg／m L的雌酮、己二烯雌酚、己烷雌酚、己烯雌酚对照品溶液及雌酮－d2、己二烯雌酚－d2、己烷雌酚－d4、己烯雌酚－d8内标溶液，按国标[5]方法，选择在负离子模式下对各目标化合物的母离子和子离子进行扫描，对碎裂电压、碰撞能量和离子化温度等质谱条件分别进行优化，以达到理想的结果。优化结果见2.2项下质谱条件。

综上所述，本研究建立的方法，操作相对简单，结果准确，灵敏度高，可用于鸡内金、土鳖虫、地龙、水蛭动物类药材中雌激素的测定。

[1]徐英江，田秀慧，张秀珍，等.超高效液相色谱串联质谱法对水产品中8种雌激素的测定[J].分析测试学报，2010，29（2）：152－156.

[2]肖 晶，邵 兵，吴永宁，等.用高压液相色谱法检测罐装食品中类雌激素双酚 A和烷基酚[J].中华预防医学杂志，2007，41（6）：449－452.

[3]湛 嘉，俞雪钧，李佐卿，等.黄鳝肌肉中11种性激素的气质联用检测方法[J].分析测试学报，2007，26（5）：642－646.

[4]林小莉，李 宁，霍 峰，等.气相色谱－质谱法同时测定饲料中6种雌激素类药物[J].分析测试学报，2016，35（3）：322－326.

[5]GB／T 21981－2008，动物源食品中激素多残留检测方法液相色谱－质谱／质谱法[S].

[6]王和兴，周 颖，姜庆五.超高效液相色谱－四极杆飞行时间串联质谱法同时分析奶粉中9种雌激素[J].分析化学研究报告，2011，39（9）：1323－1328.

[7]肖全伟，吴文林，杨万林，等.固相萃取－超高效液相色谱－串联质谱法同时测定饲料中的3种雌激素[J].色谱，2014，32（11）：1209－1213.

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Determ ination of 4 Estrogens Residue in Anim al M edicinal Herbs by UPLC－M S／M S

Zhou Wenjie1，Zhang Zhijun1，Ma Namei2
（1.Guilin Institute for Food and Drug Control，Guilin，Guangxi，China 541002； 2.Guilin Medical University，Guilin，Guangxi，China 541004）

Ob jective To establish an ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（UPLC－MS／MS）method for determination of 4 estrogens（estrone，diethylstilbestrol，hexoestrol，dienoestrol）residue in animal medicinal herbs.M ethods The sample was enzymolyzed by addingβ－glycuronidase，extrated by methanol－sodiumacelate butler satt，purified by Carb and NH2pillaret.The extract was separated on an Agilent SB－C18column（150 mm×2.1 mm，1.8μm）with gradient elution using a mobile phase consisting of acetonitrile－water.The column temperature was 35℃.The multiple reaction monitoring（MRM）was used for monitoring，and the isotope internal standard method was used for quantifying.Results The calibration curve for 4 estrogens displayed good linearity in the range of 1－200 ng／m L（r＞0.998 5）.The limit of detection of the proposed method was 1.5μg／kg，the recoveries were 70% －110%，RSD was 4.2% －15.1%.Conclusion The method has high sensitivity and good reproducibility，which can be suitable for the determination of 4 estrogens residue in animal medicinal herbs.

UPLC－MS／MS；estrone；diethylstilbestrol；hexoestrol；dienoestrol；residue delermination；animal medicinal herbs

R914.1；R931.74

A

1006－4931(2017)08－0017－04

2017－01－06)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.08.005

广西食品药品监督管理局科研项目[桂食药监科评[2 0 1 5]2 0号]。

周文杰（1985－），男，主管药师，主要从事药品质量控制研究，（电子信箱）44508397＠qq.com。