沙苑子中沙苑子苷A制备方法优化研究

王 敏，肖顺丽，曹青云，李 琦，关亮俊，张宏桂

（北京中医药大学中药学院，北京 100102）

·实验研究·

沙苑子中沙苑子苷A制备方法优化研究

王 敏，肖顺丽，曹青云，李 琦，关亮俊，张宏桂

（北京中医药大学中药学院，北京 100102）

目的 以沙苑子为原料，研究简单、高效的提取、分离、纯化沙苑子苷A的方法。方法 以沙苑子苷A的含量为指标，采用正交试验法优化醇提工艺，所得浸膏经萃取、聚酰胺、硅胶柱分离，甲醇重结晶纯化沙苑子苷A，用波谱法、薄层色谱（TLC）法、高效液相色谱（HPLC）法检查纯度。结果 最佳提取工艺条件为，提取次数为3次，加20倍乙醇，提取时间为90 min，乙醇体积分数为70%；分离纯化的沙苑子苷A经波谱法、TLC法检查与对照品一致，经HPLC法检测纯度超过98.50%。结论 优选出的最佳提取工艺提取率高、稳定性好，可为沙苑子苷A的工业化生产工艺提供指导。分离工艺已达到中药质量检测用化学对照品技术要求，所选用的分离、纯化方法简单、安全，可行性强，成本低且效率高。

沙苑子；沙苑子苷A；制备；工艺优化

沙苑子为豆科植物扁茎黄芪 Astragaluscomplanatus R.Br的干燥成熟种子[1]，分布于东北、华北及西北地区[2]。本品始载于《神农本草经》，味甘性温，归肝、肾经，有温补肝肾、固经、缩尿、明目等功效，用于肾虚腰痛、遗精早泄、白浊带下、小便余沥、眩晕目昏等病症[1]。沙苑子主要含黄酮类、三萜类、有机酸类、氨基酸等成分，其中黄酮类是沙苑子的主要有效成分，具有许多药理活性，而沙苑子苷A是沙苑子中主要的生物活性成分之一，具有保护肝细胞、抑制肝纤维化形成的作用[3－8]。沙苑子苷A是2015年版《中国药典（一部）》中规定的沙苑子药材质量检测的对照品[1]。为研究出更简单、高效的沙苑子苷A的制备方法，本试验中用聚酰胺、硅胶柱层析分离，甲醇重结晶的方法，快速、高效制得高纯度的沙苑子苷A。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 1525型高效液相色谱仪[包括Waters 2489型紫外可见检测器，SunfireTMC18色谱柱（150 mm× 4.6mm，5μm），美国Waters公司]；BS223S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；薄层色谱及柱色谱用聚酰胺（浙江台州化工厂）；薄层色谱及柱色谱用硅胶（青岛海洋化工厂）。

1.2 试药

乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；沙苑子苷A对照品（批号111803－201403）购自中国食品药品检定研究院，质量分数大于98.5%；沙苑子药材购自河北安国药材市场，经北京中医药大学张贵君教授鉴定为Astragalus complanatusR.Br的干燥近成熟种子。

2 方法与结果

2.1 沙苑子苷A含量测定

2.1.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：SunfireTMC18柱（150mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈－0.25%磷酸水溶液（24∶76）；检测波长：266 nm；流速：1.0m L／min；柱温：35℃；进样量：10μL。理论板数按沙苑子苷A峰计应不低于4 000。取对照品溶液、供试品溶液各10μL，按拟订色谱条件分别进样测定，其色谱图见图1。可见，对照品溶液、供试品溶液中沙苑子苷A峰的保留时间一致。

图1 高效液相色谱图

2.1.2 溶液制备

对照品溶液：称取沙苑子苷A对照品5mg，精密称定，加60%乙醇溶解并定容至50mL容量瓶中，摇匀，制成质量浓度为0.1 g／L的对照品溶液[9－13]。

供试品溶液：取沙苑子药材30 g，置圆底烧瓶中用60%乙醇回流提取，将滤液置已恒重过的蒸发皿中，回收乙醇后转移至真空干燥箱中至恒重，得到干浸膏，研细，称取0.05 g，精密称定，加10m L 60%乙醇溶解，称定质量，超声30min，冷却至室温后称定质量，60%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密吸取沙苑子苷A对照品溶液0.4，0.8，1.6，3.2，6.4mL，置10mL容量瓶中，加60%乙醇定容，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，分别吸取10μL注入液相色谱仪，在266 nm波长下检测，记录沙苑子苷A的峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标、对照品质量浓度（X，g／L）为横坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝3.5×107X＋8 991.9，r＝0.999 2（n＝5）。结果表明，沙苑子苷A质量浓度在0.004～0.064 g／L范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密量取质量浓度为0.016 g／L的对照品溶液10μL，按拟订色谱条件重复进样6次，测定峰面积。结果的 RSD为1.23%(n＝6)，表明仪器精密度良好。

重复性试验：精密称取相同质量的浸膏6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果沙苑子苷A的平均含量为0.063 6%，RSD为1.52%（n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液10μL，分别于0，2，4，8，12，24 h时注入高效液相色谱仪，测定峰面积。结果的 RSD为1.78%(n＝6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验：精密量取已知含量的浸膏6份，每份约0.05 g，分别加入沙苑子苷A对照品（0.016 g／L）2 m L，再加60%乙醇，超声溶解，定容至10 m L容量瓶中，按拟订色谱条件进样测定。结果见表1。

2.2 醇提工艺优选

2.2.1 正交试验设计

按 L9（34）正交表设计沙苑子苷 A的醇提工艺路线，以沙苑子苷A的含量为醇提评价指标，以提取次数（因素A）、乙醇量倍数（因素B）、提取时间（因素C）、乙醇体积分数（因素D）为影响因素进行优化，其因素水平见表2。

2.2.2 正交试验及结果

精密称取9份沙苑子粗粉，每份30 g，浸泡0.5 h，按 L9（34）正交表的条件回流提取，提取完毕后，过滤，将浓缩液转移至已恒重过的蒸发皿中，置真空干燥箱中干燥至恒重，得总浸膏。精密量取0.05 g干浸膏，用60%乙醇定容至10mL容量瓶中，摇匀，备用。结果见表3和表4。可见，以沙苑子苷A含量为指标，因素A各水平间有显著性差异（P＜0.05），故选择均值最大的水平，因素B，C，D无显著性差异。

表1 沙苑子苷A加样回收试验结果(n＝6)

表2 醇提工艺优选因素水平表

表3 沙苑子醇提正交试验及结果(n＝9)

表4 正交试验方差分析结果

2.2.3 最佳醇提工艺确定

根据大规模实际生产的要求，本着节约的原则，确定沙苑子苷A的最佳提取工艺为A3B3C2D2，即提取次数为3次，加20倍乙醇，提取时间为90min，乙醇体积分数为70%。

2.2.4 验证试验

按以上结果分析的最佳醇提工艺，分别各取3批样品进行试验，比较和验证最佳提取工艺的可靠性，结果见表5。可见，最佳工艺条件下所得结果与正交试验结果相当，表明本提取工艺研究所得结果可靠。

表5 验证试验结果

2.3 分离纯化

取沙苑子药材1 kg，按A3B3C2D2工艺条件提取，即用20倍量70%乙醇提取3次，每次90 min，提取液过滤，合并，将滤液回收至无醇味。乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，置通风橱挥干。加少量水溶解，湿法上样于聚酰胺柱，依次用水及10%和15%甲醇洗脱，收集15%甲醇洗脱部位，回收溶剂，干燥，100～200目硅胶拌样，细粉过 80目筛干法上样，用乙酸乙酯 －甲醇－水（V∶V∶V，8∶1∶0.6）洗脱，流分至1个柱体积后点聚酰胺薄层板发现开始有沙苑子苷A析出，为沙苑子苷A粗品。收集流分，收集液减压回收溶剂后，点聚酰胺板合并有相同目标物的流分。将粗品用甲醇溶解成过饱和状态，放入冰箱，低温重结晶，重复3次，干燥后即得淡黄色沙苑子苷A纯品。

2.4 结构鉴定

沙苑子苷A纯品为淡黄色粉末，盐酸－镁粉反应呈樱红色；酸水解后溶液遇斐林试剂呈阳性反应，三氯化铝反应呈黄色；二氯氧锆－枸橼酸反应鲜黄色消退。1H－NMR（DMSO－d6）：δ8.15（2H，d，J＝8.9 Hz，H－2′，6′），7.15（2H，d，J＝8.9 Hz，H－3′，5′），6.77（1H，d，J＝2.2 Hz，H－8），6.39（1H，d，J＝2.2 Hz，H－6）；5.48（1H，d，J＝7.5 Hz，H－1″），5.02（1H，d，J＝5.1 Hz，H－1″）。根据以上数据分析，与文献[13]报道一致，故确定为沙苑子苷A。

2.5 纯度测定

2.5.1 薄层色谱（TLC）检测

分别以甲醇－水（2∶3）、丙酮－水（1∶2）为展开剂，在聚酰胺薄膜上进行展开。另于硅胶G板上，以乙酸乙酯－甲醇－水（6∶1∶0.6）进行展开，以1%AlCl3乙醇溶液为显色剂，在紫外灯365 nm波长下观察。结果样品与对照品 Rf值相同，均无杂质斑点。

2.5.2 高效液相色谱（HPLC）检测

色谱条件同2.1.1项，检测波长分别为220，254，266，365 nm，样品用色谱甲醇溶解。取沙苑子苷A对照品与样品10μL进样，相应样品与对照品出峰时间一致，按面积归一化法计算，沙苑子苷A的纯度均达到98.50%，说明样品纯度符合化学对照品的质量要求。

3 讨论

现有文献关于沙苑子苷A提取分离纯化的报道较少，且专利多采用反相硅胶、凝胶等，生产成本较高，纯化过程使用的氯仿，毒性较大。另有文献报道采用超声提取[14－15]的工艺，但提取成本较高，实用性有待进一步探讨。

本试验中的制备工艺包括优化提取、萃取、聚酰胺、硅胶柱分离、甲醇重结晶4个步骤，可简单、快速地从沙苑子中分离出符合2015年版《中国药典（一部）》标准的沙苑子苷A对照品，为沙苑子苷A的相关研究和实际生产提供依据。

此外，本试验中采用价格便宜的聚酰胺和硅胶柱分离，节省了生产成本；仅用乙酸乙酯萃取，在保证萃取完全的条件下，减少了萃取次数及试剂的使用；所用重结晶的试剂为甲醇，其毒性低，对环境污染性小，可回收利用，可用于工业生产。

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Preparation M ethod of Com p lanatuside A from Astragalus Complanatus

Wang Min，Xiao Shunli，Cao Qingyun，Li Qi，Guan Liangjun，Zhang Honggui
（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing，China 100102）

Ob jective To study a simple and efficient method of extracting，separating and purifying of Complanatoside A from Astragalus Complanatus.M ethods The extraction process was optimized by orthogonal test.The extract was separated by extraction，polyamide and silica gel column，and Complanatoside A was purified by methanol recrystallization.The purity was checked by spectral，TLC，HPLC methods.Resu lts The optimum extraction conditions were as follows：the extraction time was 3 times，the ratio of liquid to material was 1∶20，the extraction time was 90 min，and the ethanol concentration was 70%.The separation and purification of Complanatoside A accorded with the reference was tested by spectral TLC method.The purity was more than 98.50% tested by HPLC method.Conclusion The best extraction process has the advantages of high extraction rate and good stability，which can provide guidance for the industrial production process of Complanatoside A.The separation process has reached the technical requirements of chemical reference materials for traditional Chinese medicine quality detection.The separation and purification method is simple，safe，feasible，low cost and high efficiency.

Astragalus Complanatus；Complanatuside A；preparation；process optimization

TQ 460.6；R284.2

A

1006－4931(2017)08－0001－04

2017－01－06；

2017－02－23)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.08.001

国家自然科学基金资助项目[3 1 0 7 0 3 2 8]。

王敏（1991－），女，硕士研究生，研究方向为中药药效物质基础，（电子信箱）wangminm18＠163.com。

张宏桂（1 9 5 5－），男，教授，研究方向为中药药效物质应用及体内代谢，（电话）0 1 0－8 4 7 3 8 6 4 2（电子信箱）b z y 7 1 4＠163.com。