中华绒螯蟹2龄早熟、晚熟选育群体和非选育群体蟹种免疫性能的比较

姜晓东，吴旭干，何 杰，刘 青,4，王幼鹏，葛永春，成永旭,4

(1.上海海洋大学，农业部淡水种质资源重点实验室，上海 201306； 2.江苏省宿迁旭邦水产科技有限公司，泗洪 223900； 3.上海登瀛水产养殖专业合作社，上海 202164； 4.上海海洋大学，上海市教委水产动物遗传育种协同创新中心，上海 201306)

中华绒螯蟹2龄早熟、晚熟选育群体和非选育群体蟹种免疫性能的比较

姜晓东1，吴旭干1，何 杰1，刘 青1,4，王幼鹏2，葛永春3，成永旭1,4

(1.上海海洋大学，农业部淡水种质资源重点实验室，上海 201306； 2.江苏省宿迁旭邦水产科技有限公司，泗洪 223900； 3.上海登瀛水产养殖专业合作社，上海 202164； 4.上海海洋大学，上海市教委水产动物遗传育种协同创新中心，上海 201306)

免疫性能是评价中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis，以下简称河蟹)蟹种质量的重要指标，采用攻毒实验和非特异免疫指标测定方法，以常规养殖未经遗传选育的养殖群体蟹种为对照组，评价了河蟹2龄早熟、晚熟选育群体第2代(G2)扣蟹的攻毒成活率和非特异性免疫指标。结果显示：(1)嗜水气单胞菌攻毒注射后，整体上未选育组扣蟹的死亡率略高于两选育群体，但是雌雄个体间具有一定的性别差异，2龄晚熟群体雄蟹和2龄早熟群体雌蟹攻毒后死亡率分别最低；(2)就肝胰腺中非特异性免疫指标而言，无论雌蟹还是雄蟹，2龄早熟群体肝胰腺中的碱性磷酸酶(ALP)活性显著高于对照组(P<0.05)，酸性磷酸酶(ACP)活性显著高于2龄晚熟组(P<0.05)；此外，两个选育组雄体肝胰腺中的总抗氧化能力(T-AOC)和过氧化物酶(POD)活性均显著高于对照组，2龄早熟G2雌体肝胰腺中的丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)均显著高于其它两组雌体；(3)就血清中非特异免疫指标而言，无论雌蟹还是雄蟹，2龄早熟G2扣蟹血清中的ACP活性均显著高于对照组，2龄晚熟G2扣蟹血清中的谷胱甘肽还原酶(GR)活性均显著低于其它两组扣蟹，此外，2龄早熟G2雌蟹血清中的γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)和T-AOC活性均显著高于2龄晚熟G2。综上，两个选育群体子二代扣蟹具有较强免疫性能及抗病力，其中2龄早熟群体扣蟹的免疫性能和抗氧化能力略强于2龄晚熟选育群体。

中华绒螯蟹； 遗传选育； 蟹种质量； 免疫性能； 攻毒实验； 比较研究

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis，以下简称河蟹)，是我国重要的养殖蟹类之一，在我国淡水水产养殖中占有极其重要的地位[1]。目前，河蟹养殖遍及我国绝大部分地区，其中长江流域河蟹养殖规模最大，产量占全国的80%左右，主要养殖未经遗传选育的长江水系河蟹[2-3]。研究表明，长江水系河蟹种质最佳[4]，在池塘养殖条件下具有生长快、成蟹规格大等优点，因此长江水系河蟹成为我国最主要的养殖群体[5-7]，但是由于多年人工繁殖和养殖过程中，采用小规格亲本近亲繁殖和不同水系间的盲目引种等原因，导致长江水系池塘养殖群体种质退化、不同品系混杂严重，表现为1龄早熟率升高，2龄商品蟹的规格变小和抗逆性降低等[6-8]。因此，我国相关单位针对河蟹生长性能已经启动多个河蟹遗传选育项目，选育出长江一号、长江二号和光合一号等多个良种，其养殖性能得到一定程度的提升[9-11]。

上市时间过分集中(10～12月)是影响河蟹养殖产业进一步发展的瓶颈问题之一，由于河蟹上市通常需要性腺发育成熟或接近成熟[12-13]，因此通过遗传育种培育不同性腺成熟时间的河蟹新品种具有重要的现实意义[7]。扣蟹是河蟹大眼幼体养殖大半年(5～12月)后的苗种，通常体质量为3～10 g，扣蟹质量好坏直接关系到第二年成蟹养殖[1]。有研究表明，长江水系养殖和野生群体扣蟹在池塘条件下养成，生殖蜕壳和性成熟时间不同，分别具有2龄早熟和晚熟特性[8]，本课题组以此为奠基群体进行良种选育，选育目标主要为降低1龄性早熟率、培育2龄早熟和晚熟品系，同时兼顾生长[7,14]。免疫性能和抗病力是评价河蟹蟹种质量的重要指标[15]，课题组尚不清楚选育2龄早熟和晚熟品系扣蟹的免疫性能，这不利于选育效果的全面评价和将来的良种推广应用。有研究表明，对虾类生长性状、抗病和成活率等性状间存在一定的关系，对一个性状的选育可能会影响到其它性状[16-18]，因此，对河蟹2龄性腺成熟时间选育是否会影响蟹种免疫性能和抗病力是值得关注和探讨的一个科学问题，对于进一步优化选育策略也具有一定的现实意义。鉴于此，本研究以未选育的池塘养殖群体为对照组，比较选育(2龄早熟和晚熟第2代选育群体)和非选育群体河蟹扣蟹攻毒后的成活率和免疫抗病性能，以期为进一步河蟹良种选育和蟹种质量评价提供科学依据和参考资料。

1 材料与方法

1.1 蟹种来源和养殖管理

实验用2龄早熟、2龄晚熟第2代选育群体(G2)和对照组非选育大眼幼体均来自上海海洋大学如东河蟹遗传育种中心，2龄早熟、2龄晚熟群体均为偶数年选育群，由本课题组于2011年底选用长江水系野生和养殖群体选育而来，经过多年选育，2014年已选育至第2代(G2)扣蟹阶段，两选育品系G2和对照组繁殖亲本的数量及平均体质量见表1，对照组雌雄亲本平均体质量分别为99 g和156 g左右，为生产上正常使用的亲本规格。3种群亲本和幼体培育均在相似的池塘条件下进行，所得大眼幼体于2014年5月中旬运至上海海洋大学崇明产学研基地进行土池养殖，养殖方法参照何杰等[7]的报道，2015年1月底从实验池塘中挑选一定数量附肢健全、活力较好的扣蟹用于后续实验。

表1 2龄早熟、晚熟G2和对照组的繁殖亲本数量及体质量Tab.1 Numbers and weights of the parent E.sinensis for breeding

注：LM表示晚熟群体，EM表示早熟群体

Note：LM represents late-maturing strains，EM represents early-maturing strains

1.2 攻毒实验

2015年1月底，分别从实验池塘中，挑选2龄早熟、2龄晚熟G2和对照组扣蟹各80 ind (雌雄各半) 用于攻毒实验，挑选扣蟹要求附肢健全、活力较好、体质量为7～10 g。攻毒前实验用扣蟹先在循环系统中暂养7 d，以适应养殖环境，暂养水族箱体积为150 L(长×宽×高=75 cm×45 cm×55 cm)，每箱放入扣蟹30 ind左右，雌雄各半。养殖环境条件为：日光灯光照，光照强度为800 lx左右，光照∶黑暗=12 h∶12 h，循环水养殖，水温(28±1)℃，pH值7.5～8.5、DO>5 mg·L-1、NH3-N<0.5 mg·L-1、亚硝酸盐<0.05 mg·L-1，投喂扣蟹配合饲料。暂养后采用毒力较强的嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophilia)Y-2-L-1菌株进行攻毒实验，菌株由上海海洋大学张庆华副教授提供。根据预实验结果确定嗜水气单胞菌注射量为2.5×106cfu·g-1蟹体重，合适的注释剂量为2.0 μL·g-1，根据每只蟹的体质量、注射剂量和总菌数将嗜水气单胞菌稀释到合适的浓度进行注射。采用微量注射器从扣蟹第三步足基部进行注射，分别设置3个重复组和1个生理盐水注射组，每组各20 ind扣蟹(雌雄各半)，攻毒后的扣蟹也养殖于体积为150 L的循环水族箱中。注射后每日仍然正常投喂，观察和记录各组扣蟹死亡情况，及时取出死亡个体，并无菌操作分离肝胰腺和头胸部肌肉中感染病原菌是否为攻毒的嗜水气单胞菌，观察时间持续7 d[15,19]。

1.3 样品采集和非特异性免疫指标测定

同时从每群体分别取雌雄扣蟹各10 ind采集血淋巴和肝胰腺用于非特异性免疫指标的测定，扣蟹规格同攻毒实验。采用1 mL无菌注射器从第三只步足基部抽取0.4 mL左右血淋巴样品装于1.5 mL离心管中，然后解剖取出所有肝胰腺装于冻存管中。所有肝胰腺和血淋巴样品于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

非特异性免疫指标测定：称取0.2 g左右的肝胰腺，加入1 mL(W/V=1∶5)预冷的生理盐水后用微型匀浆器(型号：T10B，德国IKA公司生产)匀浆30 s后在4 ℃、12 000 r·min-1条件下离心20 min，取中间清液再次离心，取中间清液用于后续分析。血淋巴解冻后用微型匀浆器匀浆30 s后，在4 ℃、12 000 r·min-1条件下离心20 min，取出上清液(血清)待测。采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮(NO)、谷胱甘肽还原酶(GR)；采用苏州科铭生物科技有限公司生产的试剂盒测定γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)；血蓝蛋白(Hc)的测定参考NICKERSON等[20]的方法，用Tris-Ca缓冲液(50 mM Tris-HCl +10 mM CaCl2, pH = 8.0)将血清稀释70倍后，在335 nm波长下比色测定OD值，血蓝蛋白(Hc)含量(mg·mL-1)= 3.717×OD335×稀释倍数。酚氧化酶(PO)的测定参考HERNNDEZ等[21]的方法，取50 μL待测样品与50 μL胰蛋白酶溶液(0.1 mg·mL-1)放入酶标孔中，室温下温育10 min，然后加入50 μL左旋多巴(L-dopa)溶液(3mg·mL-1)，室温下温育10 min后，放入酶标仪中在490 nm处测定吸光度值。1个酶活力单位定义为：每分钟每毫克蛋白吸光值变化0.001为1个酶活力单位。

1.4 数据处理

所有数据采用平均值±标准误表示。采用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计分析，用Levene法进行方差齐性检验，当数据不满足齐性方差时对百分比数据进行反正弦或者平方根处理，采用单因子ANOVA对实验结果进行方差分析，采用Tukey s-b(K)法进行多重比较；当数据转换后仍不满足齐性方差时，采用Games-Howell非参数检验对多重比较。取P<0.05为差异显著，在Excel和Sigmaplot软件上绘制相关图表。

2 结果与分析

2.1 攻毒后的累计死亡率比较

结果表明，生理盐水注射组均无死亡个体，图1为2龄早熟、2龄晚熟及对照组扣蟹攻毒后的累计死亡率变化情况。无论雄体还是雌体，扣蟹攻毒后的死亡主要发生在12～48 h，72 h后基本无死亡发生。就雄体而言，2龄早熟组死亡率一直高于2龄晚熟组，其中2龄早熟组死亡率36 h后保持不变(43.33%)，2龄晚熟组死亡率48 h后保持不变(36.67%)，对照组攻毒期间死亡率不断增加，最终死亡率(50%)高于两选育组；雌体攻毒后的累计死亡率变化情况与雄体差异较大，主要表现为2龄晚熟组累计死亡率一直高于2龄早熟组扣蟹，但最终累计死亡情况类似，仍为对照组高于两选育组；3组扣蟹雌雄平均累计死亡率变化情况为：对照组死亡率一直高于2龄早熟组和2龄晚熟组，而2龄早熟组和2龄晚熟组之间死亡率差异较小。

2.2 非特异性免疫指标比较

2.2.1 肝胰腺中非特异性免疫指标

2龄晚熟、2龄早熟及对照组扣蟹肝胰腺内非特异免疫指标如表2所示。就雄体而言，2龄早熟组ALP活性显著高于对照组且ACP活性显著高于2龄晚熟组，γ-GT活性从高到低依次为：2龄晚熟组>2龄早熟组>对照组，且差异显著(P<0.05)。对雄蟹肝胰腺抗氧化能力的影响表现为：2龄晚熟组和2龄早熟组T-AOC和POD活性显著高于对照组，2龄早熟组GSH-Px活性显著高于2龄晚熟组和对照组，对照组SOD活性最低，且显著低于2龄早熟组，各组间MDA和NO活性无显著差异(P>0.05)。

就雌蟹而言，2龄早熟组ALP活性显著高于对照组，且ACP、MDA及GSH-Px活性显著高于2龄晚熟组和对照组，2龄晚熟组γ-GT活性显著高于2龄早熟组和对照组；各组T-AOC、SOD、POD和NO活性从高到低依次为：2龄晚熟组>2龄早熟组>对照组，但差异均不显著(P>0.05)。

图1 河蟹2龄早熟、2龄晚熟选育和非选育扣蟹攻毒后的累计死亡率Fig.1 Comparison of accumulative mortality rate of three populations after challenged by Aeromonas hydrophila

表2 河蟹2龄早熟、2龄晚熟选育群体和非选育群体扣蟹肝胰腺中非特异性免疫指标Tab.2 Comparison of immune indices and antioxidant ability in the hepantopancrea of juvenile E. sinensis from three populations

注：表中上标不同小写字母表示同一免疫指标在不同群体间差异显著(P<0.05)

Note：Data with different lowercase letters for the same immune index among different populations indicate significant differences(P<0.05)

2.2.2 血淋巴中非特异性免疫指标

2龄晚熟、2龄早熟及对照组扣蟹血淋巴内非特异免疫指标如表3所示。就雄体而言，2龄早熟组和对照组GR活性显著高于2龄晚熟组，对照组NO含量显著高于2龄早熟组，ALP、ACP、PO及GSH-Px活性以2龄早熟组最高，其中ACP活性差异显著，此外γ-GT、T-AOC、SOD、MDA及Hc活性以2龄晚熟组最高，其中SOD活性差异显著，其余各指标差异均不显著。

就雌蟹而言，2龄早熟组ACP、γ-GT及T-AOC活性显著高于2龄晚熟组和对照组，2龄早熟组和对照组GR活性显著高于2龄晚熟组，2龄晚熟组和2龄早熟组SOD活性显著高于对照组；ALP、NO及MDA活性以对照组最高，其中ALP活性差异显著，而其余各指标(PO、GSH-Px、NO、MDA及Hc)差异均不显著。

3 讨论

3.1 攻毒后各组成活率差异及其原因

活体攻毒实验是综合评价动物体健康状况和免疫性能的常用手段，在一定剂量致病原的攻击下，免疫性能较强的个体或群体表现为较低的累积死亡率和较高的成活率，通常免疫性能较强的个体对病原的半致死浓度也较高[22]。本研究中在相同浓度的嗜水气单胞菌注射条件下，整体上2龄早熟和2龄晚熟选育扣蟹的累计死亡率低于对照组，这显示两选育群体扣蟹的免疫性能得到了一定的提升。选育组攻毒后死亡率相对较低，可能与连续多代采用活力较强的亲本进行繁殖有关，在对虾遗传选育过程中也有类似发现[17]。本研究中2龄早熟和2龄晚熟扣蟹攻毒最终死亡率相对于对照组分别降低了10.00%和8.34%，低于先前对虾抗病选育后攻毒死亡率的降低量，如凡纳滨对虾 (Litopenaeusvannamei) 抗桃拉氏病毒选育三代后，攻毒成活率提高了15%～35%[23-25]，这是由于抗病选育主要针对于特定病原，可以显著提高该病原攻毒后成活率；而本研究中以提前或推迟性腺发育时间为主要选育指标，且嗜水气单胞菌攻毒实验主要反映苗种的整体抗病性能，故攻毒后死亡率降低程度没有针对特定病原选育后的效果明显[17]。

表3 河蟹2龄早熟、2龄晚熟选育群体和非选育群体扣蟹血清中非特异性免疫指标Tab.3 Comparison of immune indices and antioxidant ability in the hemolymph of juvenile E. sinensis from three populations

注：表中上标不同小写字母表示同一免疫指标在不同群体间差异显著(P<0.05)

Note：Data with different lowercase letters for the same immune index among different populations indicate significant differences(P<0.05)

3.2 非特异免疫和抗氧化性能差异

大量研究表明，ALP和ACP是水生动物机体非特异免疫系统中的两种重要水解酶，其活性和免疫性能有很大关系[26]，它们能够杀死外来入侵的病原体，并能通过修改病原表面分子来加速吞噬细胞的吞噬以及异物的降解速度[27]，而GSH-Px是生物体抗氧化防御系统的关键酶[28]，能够催化GSH将机体代谢过程中产生的脂质过氧化物或过氧化氢还原成无害醇类(或H2O)，从而达到减轻和阻断脂质过氧化目的，起到保护细胞免受氧化损伤的作用[29]。本研究结果表明，2龄早熟扣蟹肝胰腺和血淋巴中ALP、ACP和GSH-Px均高于2龄晚熟组和对照组扣蟹，这说明2龄早熟组扣蟹可能比2龄晚熟扣蟹具有更强的非特异免疫性能和抗氧化能力。这可能是因为2龄晚熟群体奠基群为长江水系野生群体，经过人工繁殖和池塘养殖仅有两代，远短于经过多代人工养殖的2龄早熟群体[6]，有研究表明经过多代人工养殖和选育的对虾群体或家系抗病力强于野生对虾群体[17]；此外，甲壳动物的生长和免疫性能可能呈负相关[30]，通常生长较快的个体抗病力和免疫性能较差，先前研究表明2龄早熟群体由于性成熟提前，成蟹养殖阶段的生长略差于2龄晚熟群体[14]。因此，2龄早熟群体的免疫性能略好于2龄晚熟群体。

综上，两个选育群体子二代扣蟹具有较强的免疫性能及抗病力，其中2龄早熟群体扣蟹的免疫性能和抗氧化能力略强于2龄晚熟选育群体，说明以性腺成熟时间为选育目标也会影响到其它经济性状，这为今后进行河蟹多性状复合育种提供了思路。今后，需要针对河蟹生长、性腺成熟时间、营养品质和免疫抗病等多种经济性状，研究和建立河蟹多性状复合选育技术体系。

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Comparison of immune performance of juvenile crabseeds among the second instar early-maturing, late-maturing and non-selective populations of Chinese mitten crabEriocheirsinensis

JIANG Xiao-dong1, WU Xu-gan1, HE Jie1， LIU Qing1,4, WANG You-peng2, GE Yong-chun3, CHENG Yong-xu1,4

(1.KeyLaboratoryofFreshwaterAquaticGeneticResources,MinistryofAgriculture,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China; 2.SuqianXubangFisheriesScienceandTechnologyLtd.Co.,JiangsuSihong223900,China; 3.ShanghaiDengyingAquacultureCooperatives,Shanghai,Chongming202164,China; 4.CollaborativeInnovationCentevofAquaticAnimalBreedingCenterCertificatedbyShanghaiMunicipalEducationCommission,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

The mature or nearly mature Chinese mitten crabs(Eriocheirsinensis) generall have higher edible yield and nutritional value than the unmature crabs, and the second instarE.sinensisordinarly become mature or nearly mature from late October to end of December. In this period, the mature individuals ofE.sinensisare concentrated to flood the market. It takes many problems like low price that need to solute. So the extension of maturing time of second instar adultE.sinensisis one of the important factors for the sustainable development of the farming industry of this crab. Previous studies have shown that selective breeding is the effective method to change the mature time for animals. Since 2011, the second instarE.sinensisof early-maturing(ENN) and late-maturing(LM) have been established and reproduced to the third generation, but little is known about the effects of selective breeding on the quality of juvenileE.sinensis. The immune performance is an important criteria for the evaluation of crabseed quality. Therefore, this study aimed to evaluate the survival performance during the pathogen challenge test and determine the immune indices of juvenile crabs of EM, LM and non-selective populations (as the control). The results showed that: (1) The cumulative mortality rate of the control was lower than EM and LM for both males and females during the pathogen challenge test, but there were slight differences between males and females. While the lowest mortality was found in the males of LM and females of EM, respectively. (2) In terms of the non-specific immune indicies of the hepatopancreas, EM had the higher activity of ALP and it had higher activity of ACP than LM for both males and females (P<0.05). In addition, the male EM and LM had the significantly higher T-AOC and POD than the control, and the MDA and GSH-Px of female EM were significantly higher than those of the females from the other two populations(P<0.05); (3) In terms of the non-specific immune indicies in hemolymph, for whether males or females, EM had higher ACP activity than the control while LM had the lowest GR activity among three populations. Furthermore, female EM had significantly higher activity of γ-GT and T-AOC than female LM(P<0.05). In conclusion, the crabseeds from early-maturing (EM) and late-maturing (LM) strains have the better disease resistance and immunity than non-selective populations, and the EM has the slightly better performance on indices of antioxidation and immunity than the LM.

Eriocheirsinensis; mass selective-breeding; crabseed quality; immune performance; pathogen challenge test; comparative study

1004-2490(2017)02-0181-09

2016-03-03

科技部港澳台科技合作专项项目(2014DFT30270); 科技部科技型中小企业技术创新项目 (14C26213201214)；上海市科委科研计划项目 (13231203504)；上海高校水产学高峰学科建设项目(2015-62-0908)

姜晓东(1991-),男,硕士研究生,主要从事河蟹养殖技术和良种培育的研究。E-mail:310410555@qq.com

成永旭,教授。 E-mail:yxcheng@shou.edu.cn

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