加味黄芪赤风汤对阿霉素大鼠肾脏保护及自噬水平的调控作用❋

于子凯，杨 斌，张 昱，王金虎，张 秋，郝 伟，赵晋宁

(中国中医科学院西苑医院，北京 100091)

【实验研究】

加味黄芪赤风汤对阿霉素大鼠肾脏保护及自噬水平的调控作用❋

于子凯，杨 斌，张 昱△，王金虎，张 秋，郝 伟，赵晋宁

(中国中医科学院西苑医院，北京 100091)

目的：观察加味黄芪赤风汤对阿霉素肾病大鼠肾脏的保护作用及其对自噬相关蛋白LC3和Beclin-1表达的影响。方法：设立空白、模型、替米沙坦及加味黄芪赤风汤组，光镜下观察肾组织病理学变化，免疫组化法检测FN、LN、LC3和Beclin-1的表达及分布。结果：加味黄芪赤风汤可保护阿霉素肾病大鼠肾脏，显著抑制肾组织中的FN、LN，显著拮抗自噬相关蛋白LC3、Beclin-1的过度表达。结论：加味黄芪赤风汤通过调控自噬水平对阿霉素肾病大鼠肾脏起到保护作用。

加味黄芪赤风汤；自噬；阿霉素肾病；蛋白尿

蛋白尿是慢性肾脏病的主要临床表现，长期蛋白尿可加速肾脏病的进展，是慢性肾脏病发展为肾衰竭的重要因素[1]。自噬( autophagy) 是在环境压力条件下细胞保持存活高度保守的体内平衡机制，是细胞依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一种过程，为细胞内的再循环系统[2-3]。Fougeray S等研究表明，在肾脏病防治方面，自噬可作为新的作用靶点[4]。从中医药治疗角度对自噬进行相关研究可为肾脏病蛋白尿的防治提供全新的线索及思路。加味黄芪赤风汤是张昱主任医师创制的治疗慢性肾脏病蛋白尿的有效方剂。前期研究表明，加味黄芪赤风汤能够明显改善阿霉素肾病大鼠蛋白尿，保护肾功能，提高抗自由基能力，改善肾脏自由基损伤，并能够提高血清一氧化氮(nitric oxide，NO)含量，降低血清内皮素(endothelin-1,ET-1)及转化生长因子(transforming growth Factor-β1,TGF-β1)含量，对延缓肾小球硬化及肾脏纤维化的发展有积极意义[5-6]。本实验以阿霉素肾病大鼠为研究对象，研究加味黄芪赤风汤对肾脏组织的保护作用及其对自噬相关蛋白(light chain 3，LC3)和Beclin-1的影响，为加味黄芪赤风汤的临床应用提供科学依据。

1 材料

1.1 动物

健康雄性SD大鼠40只，体质量(220±18)g，月龄2～3个月，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，于中国中医科学院西苑医院SPF级动物房饲养，所有动物实验前适应性喂养3 d。

1.2 药品与试剂

加味黄芪赤风汤组成：生黄芪30 g, 芡实、金樱子各20 g, 赤芍、防风、地龙、白花蛇舌草各10 g，生药饮片由中国中医科学院西苑医院药剂科鉴定。替米沙坦，即美卡素Boehringer Ingelheim International GmbH生产(进口药品注册证号H20090416，H20090417)，注射用盐酸多柔比星(速溶性)PfizerItalia s.r.l.生产(进口药品注册号H20080278，进口药品注册标准Jx20000016)，免疫组化抗体由abcam公司生产(货号分别为ab52167，ab32351)，二抗(PV-6000)通用型二步法免疫组化检测试剂盒、DAB试剂盒为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。

1.3 实验仪器

ES-1100型电子天平(长沙湘平科技发展有限公司)，TB-718型生物组织包埋机(常州市中威电子仪器有限公司)，RM2235型组织切片机(德国Leica)，HI1220型烤片机(德国Leica)，ST5020型全自动组织脱水机(德国Leica)，Olympus-bx51型显微镜(日本)，Anymicro DSSTM型图像分析仪(北京裕天世纪伟业科技有限公司)，转移电泳槽(BIO-RAD公司)，垂直板电泳槽(BIO-RAD公司)，PowerPacTM通用型电源(BIO-RAD公司)，脱色摇床(TS-1型，江苏海门市麒麟医用仪器厂)，电子分析天平(AE240型，METTLER公司)，37℃水浴箱(北京长风仪器仪表公司)，冷冻离心机(MIKRO022R，LABWAY science公司)，制冰机 (F100，LABWAY science公司)，ChemicDocTM XRS+ Image LabTM凝胶图像分析管理系统(BIO-RAD公司)，-70℃超低温冰箱(Jauan VxE 380)。

2 方法

2.1 造模与分组

实验第1天，将SD大鼠随机分为空白组10只与阿霉素肾病组30只。空白组尾静脉一次性注射等量生理盐水，并每日灌服等体积生理盐水；阿霉素肾病组采用尾静脉一次性注射阿霉素6.2 mg/kg的方法造模[7]，2周后用干化学法测定大鼠小便中的尿蛋白。造模成功标准：大鼠尿蛋白呈(++++)为造模成功，经过检测本实验造模成功，再将阿霉素肾病大鼠按随机数字表法分为4组各10只。其中模型组10只，每日灌服等体积生理盐水；正常剂量加味黄芪赤风汤组10只，每日按生药11.46 g/kg以水煎剂灌服；替米沙坦组10只，每日按8.33 mg/kg灌服替米沙坦混悬液。各组灌服均从造模后第2周末开始，持续至实验第8周末结束。

2.2 观察指标及方法

2.2.1 光镜检测肾组织病理结构变化 在第8周末处死大鼠后迅速手术剥离肾脏取肾皮质，用10%甲醛固定、石蜡包埋，HE、PASM及Masson分别染色，制成薄切片用于光镜检查，其余肾皮质保存于-70℃冰箱。

2.2.2 免疫组化染色法 检测纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、层黏连蛋白(laminin，LN)、LC3及Beclin-1的定位及分布。二甲苯脱蜡，高压热修复，降至室温，PBS洗后滴加一抗，4℃冰箱过夜，室温放置30 min后PBS洗滴加二抗，室温放置30 min，PBS洗后室温DAB显色，显微镜下观察目标出现阳性后苏木素复染细胞核，氨水返蓝，中性树胶封片，图像采集并分析，以免疫组织化学染色阳性信号累积光密度(IOD)作为组织表达的定量标准。IOD=平均光密度(AOD)× 阳性面积(A)。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 肾组织病理结构改变

图1显示，空白组肾组织经HE、PAS、MASSON染色后光镜下可见，肾小球结构清晰完整，球囊比例正常，小球内未见系膜细胞和系膜基质增生，肾小管排列有序，小管上皮细胞如常。模型组则出现肾小球毛细血管球扩张，系膜细胞增生，系膜基质明显增多，局部毛细血管结构塌陷；肾小管排列紊乱，囊性扩张，小管上皮细胞变性，基底膜增厚。加味黄芪赤风汤组及替米沙坦组肾小球和肾小管病变均有不同程度的减轻。

图1 各组大鼠肾脏病理变化

3.2 肾组织中FN、LN、Beclin-1及LC3的表达与分布

图2表1显示，FN、LN均为浆表达，表达于肾小球系膜基质和肾小管上皮细胞周围基底膜。与空白组比较，模型组肾组织中FN、LN蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较，加味黄芪赤风汤组肾组织中FN、LN蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；LC3为浆、核表达，表达于肾小球和肾小管上皮细胞中，Beclin-1为浆表达，主要表达于肾小球，与空白组比较，模型组肾组织中LC3、Beclin-1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，加味黄芪赤风汤组及替米沙坦组肾组织中LC3、Beclin-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。

图2 各组大鼠肾脏组织中FN、LN、Beclin-1及LC3免疫组化染色分布图

组 别鼠数FNLNLC3Beclin⁃1空白组10880 30±65 56970 60±39 871200 35±65 30950 23±65 30模型组101800 35±43 80▲1700 50±61 30▲2500 63±60 86▲1800 29±40 32▲加味黄芪赤风汤组101200 28±68 00△1288 76±39 67△1535 65±39 87△1105 36±60 95△替米沙坦组101288 76±43 96△1360 36±58 97△1596 80±60 56△1196 76±63 70△

注:与空白组比较:▲P<0.05；与模型组比较:△P<0.05

4 讨论

加味黄芪赤风汤出自清·王清任《医林改错》中的黄芪赤风汤，是张昱主任医师在对慢性肾脏病蛋白尿“虚、瘀、毒、风”复杂病机认识的基础上将其加减化裁而成。方中重用生黄芪健脾益气，赤芍活血化瘀，芡实、金樱子健脾升清、补肾固精，穿山龙、防风祛除肾络风邪，白花蛇舌草清热解毒，全方共奏补肾健脾、祛风解毒、活血化瘀之功，临床应用加味黄芪赤风汤治疗慢性肾脏病蛋白尿疗效显著[8]。

FN及LN是细胞外基质的主要成分，FN可以同时与细胞外基质各类成分相结合，并促进细胞外基质其他成分沉积，LN可以引起细胞黏附并影响基底膜的电荷选择性[9]，二者在纤维化的早期即可形成并广泛沉积，是观察组织纤维化的常用指标[10]。本研究观察到，加味黄芪赤风汤对阿霉素大鼠肾脏病理有明显改善及保护作用，同时通过抑制FN及LN蛋白的表达抗肾小球硬化。

自噬是维持细胞内环境稳定的重要机制，自噬通过清除长寿命蛋白质和受损细胞器，在肾脏处理各种应急的病理生理过程中发挥着关键保护作用，但是自噬的过度表达将会导致细胞器的受损[11]。研究显示[12]，通过特异性敲除足细胞自噬相关基因Atg5，模拟构建了自噬缺乏的衰老足细胞的模型，高龄小鼠自噬功能被过度抑制，导致体内氧化蛋白蓄积，出现内质网应激并表现蛋白尿，最终导致足细胞损伤丢失及肾小球硬化。一旦自噬活性持续亢奋，可加剧肾脏损伤，可见自噬是一把双刃剑，过度表达或高度抑制均可对肾脏造成病理损伤[13-14]。Beclin-1[15]在细胞自噬途径相互交流和协调的过程中发挥关键作用，其可通过将自噬相关蛋白定位于吞噬泡中，参与到自噬体形成的整个过程中，在自噬体的成熟过程中，Beclin-1同样扮演着重要角色。LC3可作为自噬体形成的标志一直存在于自噬体中。本研究结果表明，与空白组比较，模型组大鼠肾脏组织中Beclin-1、LC3蛋白表达水平较显著升高。该结果表明，阿霉素诱导大鼠肾脏过度自噬从而引起肾脏病理损伤，而加味黄芪赤风汤与替米沙坦也能不同程度地提高Beclin-1、LC3蛋白的表达。但是与模型组比较，加味黄芪赤风汤与替米沙坦均能不同程度地拮抗Beclin-1、LC3蛋白的过度表达。可见，在一定程度上调Beclin-1、LC3蛋白的表达，减少肾脏病理损伤，但是Beclin-1、LC3蛋白的过度表达可加重肾脏病理损伤。本研究结果表明，加味黄芪赤风汤可提高自噬基础活性并维持自噬活性处于平衡状态，进而保护肾脏组织，减少肾脏病理损伤。

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Protective Effect of Modified Huangqi Chifeng Decoction on Adriamycin Nephrosis(AN) Rats kidney and Its Regulated Effect on Its Autophagy level

YU Zi-kai, YANG Bin, ZHANG Yu△,WANG Jin-hu,ZHANG Qiu,HAO Wei,ZHAO Jin-ning
(XiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100091,China)

Objective:To explore the effect of Modified Huangqi Chifeng Decoction on adriamycin nephrosis(AN) rats and its effect on the expression of LC3 and Beclin-1.Methods：To set up blank、model、Telmisartan and Modified Huangqi Chifeng Decoetion group.The changes of kidney tissue pathology were detected after light microscopy. The localization and distribution of FN、LN、LC3 and Beclin-1were detected by Immunohistochemical staining.Results:Modified Huangqi Chifeng Decoction can protect kidney tissue pathology，significantly restrain the expression of FN and LN，significantly restrain the expression of the autophagy-related proteins LC3 and Beclin-1. Conclusion:Modified Huangqi Chifeng Decoction can protect kidney tissue pathology through regulating the autophagy level.

Modified HuangqiChifeng Decoction;Autophagy;Adriamycin nephrosis;Proteinuria

中国中医科学院自主选题研究项目(ZZ0708105)-加味黄芪赤风颗粒治疗慢性肾脏病(1-2期)蛋白尿的疗效及其机理研究

于子凯(1990-)，男，河南郑州人，在读硕士，从事中西医结合慢性肾脏病的防治与研究。

△通讯作者：张 昱(1965-)，男，北京人，主任医师，教授，医学博士(后)，博士研究生导师，从事中医肾脏病的临床与基础研究,E-mail：zhangyu8225@163.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)04-0477-03

2016-10-21